@phdthesis{Morlock2018,
  author    = {Lisa Morlock},
  title     = {Investigation on the general activity and uncoupling of the catalytic cycle of different cytochrome P450 monooxygenase},
  journal    = {Untersuchung der generellen Aktivit{\"a}t und der Entkopplung des katalytischen Zyklus verschiedener Cytochrom P450 Monooxygenasen},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-23384},
  pages     = {161},
  year      = {2018},
  abstract  = {Cytochrom P450 Monooxygenasen wurden in den 1940er Jahren entdeckt und wurden seither intensiv erforscht. Obwohl sie sehr interessante Reaktionen katalysieren, die Anwendung in der Produktion von Feinchemikalien und Pharmazeutika finden k{\"o}nnten, wird ihre Wirtschaftlichkeit meist durch ihre Aktivit{\"a}t und Stabilit{\"a}t negativ beeinflusst. Beide Eigenschaften, die Aktivit{\"a}t und die Stabilit{\"a}t, werden durch die Entkopplung des katalytischen Zyklus beeinflusst. Im Rahmen dieser Doktorarbeit, wurde ein Assay f{\"u}r das „screening“ auf Aktivit{\"a}t und Entkopplung erfolgreich entwickelt. Nachdem optimale Reaktionsbedingungen f{\"u}r das Assay identifiziert waren, wurde die Entkopplung von Cytochrom P450 BM3 und f{\"u}nf Mutanten (F87Y, R47L, Y51F, A82L and T268A) mit verschiedenen Substraten untersucht. Obwohl bereits viele andere Wasserstoffperoxid Detektionsmethoden beschrieben wurden, war die Kombination einer parallelen Bestimmung der NADPH Abnahme und der Wasserstoffperoxid Bildung neu. Dieser parallele Ansatz stellt eine gute Basis f{\"u}r ein „pre- screening“ gro{\"s}er Mutantenbibliotheken dar, worauf eine detaillierte Untersuchung von ausgew{\"a}hlten Varianten folgt. Um die Aktivit{\"a}t des CYP11A1 Systems, bestehend aus CYP11A1, Adx und AdR als Redox Partner System, untersuchen zu k{\"o}nnen, wurde zun{\"a}chst die Expression und Aufreinigung aller drei Proteine untersucht. F{\"u}r die Proteine CYP11A1 und Adx, wurden gute Expression Levels erreicht, wohingegen die Konzentration f{\"u}r AdR sehr gering war. F{\"u}r alle drei Proteine wurde nach Aufreinigungsversuchen eine konzentrierte L{\"o}sung erhalten, die jedoch noch andere Proteine enthielt. Daher wurde in der Masterarbeit von Christopher Grimm, die pH und Temperaturstabilit{\"a}t aller drei Proteine untersucht, um die Bedingungen w{\"a}hrend der Ionenaustauschchromatographie als Aufreinigungsmethode optimieren zu k{\"o}nnen und optimale Bedingungen f{\"u}r in vitro Biokatalysen zu finden. Leider wurde trotz weiterer Expressionsversuche mit AdR keine Verbesserung erzielt, wodurch ein Ganzzellsystem als n{\"a}chstes untersucht wurde. F{\"u}r dieses System konnte die Produktbildung auf 2.2\%, achtfach erh{\"o}ht werden, im Vergleich zu den publizierten 0.27\% Umsatz nach 24h durch die Verwendung eines anderen Detergenz zur L{\"o}sung des Substrates Cholesterol, wodurch vermutlich die Bereitstellung des Substrates f{\"u}r das Enzym erleichtert wurde. Auf Grund der beobachteten geringen Aktivit{\"a}t und Stabilit{\"a}t, wurde anschlie{\"s}end ein weiteres P450 System untersucht, das CYP17A1 Enzym. Zun{\"a}chst wurden in vitro Biokatalysen mit dem humanen CYP17A1 durchgef{\"u}hrt, welches in E. coli exprimiert wurde. Nachdem verschiedene Redox-Partner Systeme getestet wurden, erzielte das Pdx/PdR System von P. putida in Kombination mit dem CYP17A1 Enzym den h{\"o}chsten Umsatz, mit 91\% nach 24 h. Um die Aktivit{\"a}t des Enzyms n{\"a}her zu untersuchen, wurden alle Aminos{\"a}uren in einem Abstand von 4 {\AA} zum gebundenen Substrat durch Alanine ersetzt. Alle Varianten wurden exprimiert, jedoch konnte kaum richtig gefaltetes Protein erhalten werden. Auch nachdem verschiedene Puffer untersucht wurden, zur eventuellen Stabilit{\"a}tserh{\"o}hung, konnte keine Verbesserung festgestellt werden. Deshalb wurde auch hier auf einen Ganzzellansatz zur{\"u}ckgegriffen. Dieser bestand aus dem Enzym aus Rind welches in S. cerevisiae exprimiert wurde. Mit diesem System, wurde die Bedeutung der Positionen N202, R239, G297, E305 und T306A best{\"a}tigt, die in der Literatur als wichtig f{\"u}r die katalytische Aktivit{\"a}t beschrieben werden. Am wichtigsten waren drei Positionen, die die Regioselektivit{\"a}t des Enzyms ver{\"a}ndern. Die Reaktion der V483A-Mutante wurde daher auch durch pr{\"a}parative Biokatalyse weiter untersucht. Danach wurde das neue Produkt durch pr{\"a}parative HPLC getrennt und als 16α-Hydroxyprogesteron identifiziert, was mittels NMR-Spektroskopie best{\"a}tigt werden konnte. Im letzten Teil der Arbeit wurde ein weiterer Screening-Ansatz f{\"u}r ein m{\"o}gliches Hochdurchsatz-Screening untersucht. Im Gegensatz zum bereits beschriebenen Screening- Ansatz wurde hier die Untersuchung der Substratumwandlung und der Wasserstoffperoxidbildung f{\"u}r den Einsatz in „droplets“ optimiert. Nachdem festgestellt wurde, dass DCFH-DA gegen{\"u}ber Wasserstoffperoxid nicht empfindlich genug war, wurde das AmplifluTM Red / HRP System verwendet. Da beide fluoreszierenden Produkte oberhalb von pH 7,4 in der w{\"a}ssrigen Phase blieben, wurden die f{\"u}r den AmplifluTM Red Assay untersuchten Bedingungen angewendet. Das NADPH-Substrat-Verh{\"a}ltnis wurde mit einer Entkopplungsvariante, einer aktiven Variante aus der Literatur und dem Cytochrom P450 BM3 Wildtyp-Enzym untersucht. Nach Ermittlung eines guten Verh{\"a}ltnisses wurden die f{\"u}nf f{\"u}r die Untersuchung des AmplifluTM Red Assays verwendeten Varianten in der gleichen Konzentration untersucht, die sp{\"a}ter in den „droplets“ gefunden wird (1 Zelle pro 4 pL). Hier zeigte eine Variante eine verbesserte Produktbildung im Vergleich zum Wildtyp. Dieser Befund zeigt deutlich die Anwendbarkeit des Assays f{\"u}r Hochdurchsatzscreening in „droplets“.},
  language  = {en}
}