@phdthesis{Schwefel2020, author = {Konrad Schwefel}, title = {Funktionale und molekulare Charakterisierung der CRISPR/Cas9-vermittelten CCM3-Inaktivierung in humanen Endothelzellen}, journal = {Functional and molecular characterisation of CRISPR/Cas9-mediated CCM3 inactivation in human endothelial cells}, url = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-38603}, year = {2020}, abstract = {Zerebrale kavern{\"o}se Malformationen (CCMs) sind vaskul{\"a}re Fehlbildungen des zentralen Nervensystems, welche sich klinisch durch epileptische Anf{\"a}lle, fokale neurologische Ausf{\"a}lle und Kopfschmerzen {\"a}u{\"s}ern. Sie treten sowohl sporadisch als auch im Rahmen einer autosomal-dominant erblichen Form auf. Krankheitsassoziierte Varianten wurden in drei Genen beschrieben: CCM1, CCM2 und CCM3. Patienten mit pathogenen Varianten im CCM3-Gen fallen h{\"a}ufig durch einen schwereren Ph{\"a}notyp und ein fr{\"u}heres Manifestationsalter auf. Der genaue Verlauf der molekularen CCM-Pathogenese ist jedoch bisher nicht ausreichend verstanden. In dieser Arbeit wurde deshalb die Entwicklung eines humanen in vitro Modells in den Fokus gestellt. Im Gegensatz zu bisher publizierten Studien, die auf einer transienten Herunterregulation von CCM3 beruhen, wurden hier die Folgen eines Langzeit-CCM3-Verlustes untersucht. Unter Verwendung der Komponenten des CRISPR/Cas9-Systems wurde ein Modell etabliert, welches die komplette Inaktivierung von CCM3 in kavern{\"o}sen Endothelzellen von Tr{\"a}gern heterozygoter pathogener Keimbahnvarianten nachahmt. In humanen Endothelzellen f{\"u}hrte die CRISPR/Cas9-vermittelte CCM3-Inaktivierung zu ver{\"a}nderten endothelialen Eigenschaften, welche die Morphologie, die Apoptoseinduktion, die Stabilit{\"a}t kapillar{\"a}hnlicher Strukturen sowie die Sph{\"a}roidorganisation umfassen. Zudem kam es zu einer vermehrten Aktin-Stressfaserbildung. Auf molekularer Ebene war eine ver{\"a}nderte Expression von Genen zu beobachten, deren Produkte eine Rolle in der Regulation von Zellverbindungen, der Zellmembran oder der extrazellul{\"a}ren Matrix spielen. Insbesondere das unter Basalbedingungen stark in Endothelzellen exprimierte Fibronektin war signifikant herunterreguliert. Die Zugabe exogenen Fibronektins konnte die Zellmorphologie, die Sph{\"a}roidorganisation und die kortikale Anordnung des Aktin-Zytoskelettes normalisieren. Da auch nach CRISPR/Cas9-induzierter Inaktivierung von CCM1 und CCM2 diese Effekte beobachtet werden konnten, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der Aufbau einer intakten fibronektinhaltigen endothelialen Matrix von der Funktionalit{\"a}t der CCM-Proteine abh{\"a}ngt. K{\"u}nftige Studien werden die Modulation der gest{\"o}rten endothelialen Apoptoseinduktion als neuen Ansatz zur Identifizierung medikament{\"o}ser Therapieoptionen adressieren.}, language = {de} }