@phdthesis{Sommer2020,
  author    = {Marie-Christine Sommer},
  title     = {Der Einfluss von kaltem Atmosph{\"a}rendruckplasma auf die Melaninsynthese in humanen Melanozyten},
  journal    = {The influence of cold atmospheric pressure plasma on melanin synthesis in human melanocytes},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-44161},
  year      = {2020},
  abstract  = {Das zur Behandlung von chronischen Wunden zugelassene Plasmager{\"a}t kINPen®MED wurde in der vorliegenden Arbeit hinsichtlich eines m{\"o}glichen Effektes auf die Pigmentierung der Haut in vitro untersucht. Dazu wurden zun{\"a}chst Untersuchungen an Melanomzellen durchgef{\"u}hrt. Verschieden stark pigmentierte Melanomzelllinien wurden einer indirekten Plasmabehandlung ausgesetzt, das hei{\"s}t mit plasmabehandeltem Zellkulturmedium inkubiert, und der Melaningehalt wurde vor und nach der Behandlung durch eine UVspektroskopische Analyse evaluiert. Im Vergleich zu den unbehandelten Zellen war der Melaningehalt aller getesteten Melanomzelllinien erh{\"o}ht. Auch im Vergleich zu Zellen, die mit den Positivkontrollen IBMX beziehungsweise NH4Cl / Tyrosin behandelt wurden, zeigte sich ein verst{\"a}rkter Effekt der Plasmabehandlung auf die Pigmentierung der Melanomzellen. Da Melanomzellen nicht in erster Linie das Ziel von therapeutisch indizierten Beinflussungen der Pigmentierung sind, wurde im n{\"a}chsten Schritt die Bestimmung des Melaningehaltes von prim{\"a}ren Melanozyten nach in vitro-Plasmabehandlung durchgef{\"u}hrt. Dazu wurde zun{\"a}chst die Methode zur relativen Melaninquantifizierung grundlegend {\"u}berarbeitet. Es wurden zwei verschiedene Methoden zur verbesserten Melaninanalytik entwickelt, die hinsichtlich der ben{\"o}tigten Probenmenge im Vergleich mit der UV- spektroskopischen Melaningehaltsbestimmung im Melanomzellmodell eine h{\"o}here Sensitivit{\"a}t aufweisen. Die erste Methode basiert, wie in der Literatur beschrieben, auf der Oxidation des Melanins in alkalischer L{\"o}sung durch Wasserstoffperoxid und anschlie{\"s}ender Analyse der melaninspezifischen Abbauprodukte. Die bestehende Methode wurde um eine massenspektrometrische Detektion der Abbauprodukte erweitert, was eine Reduktion der ben{\"o}tigten Probenmenge um den Faktor 10 erm{\"o}glichte bei Erhalt der Differenzierungsm{\"o}glichkeit zwischen Eumelanin und Ph{\"a}omelanin. Die Analyse von prim{\"a}ren Melanozyten nach indirekter Plasmabehandlung im Vergleich mit unbehandelten Melanozyten ergab eine geringe Steigerung des Eumelaningehaltes in Melanozyten eines stark pigmentierten Spenders, der Ph{\"a}omelaningehalt blieb unver{\"a}ndert. Der als Positivkontrolle verwendete cAMP-Abbau-Inhibitor IBMX erh{\"o}hte sowohl den Eu- als auch den Ph{\"a}omelaningehalt. Die zweite Methode zur Bestimmung des relativen Melaningehaltes beruht auf der Autofluoreszenz des Melanins, die bei einer Anregungswellenl{\"a}nge von 785 nm im NIRBereich zu beobachten ist. Unter Verwendung der Durchflusszytometrie konnte eine Einzelzellanalyse der prim{\"a}ren Melanozyten hinsichtlich ihrer Autofluoreszenzintensit{\"a}t durchgef{\"u}hrt werden. Dabei korrelierten die erzielten Ergebnisse der relativen Intensit{\"a}ts{\"a}nderung mit denen der massenspektrometrischen Quantifizierung der Melaninabbauprodukte. Gegen{\"u}ber der unbehandelten Kontrolle war der Melaningehalt nach indirekter Plasmabehandlung geringf{\"u}gig gesteigert. Nach Behandlung der Zellen mit IBMX als pharmakologischer Positivkontrolle sowie infolge einer Behandlung mit direkter UVStrahlung als physikochemischer Positivkontrolle war jedoch ein st{\"a}rkerer Effekt auf die Steigerung der Melaninproduktion als bei der indirekten Plasmabehandlung zu beobachten. Die in vitro erhaltenen Ergebnisse konnten auf ein komplexeres Modell {\"u}bertragen werden, indem eine direkte Plasmabehandlung von Hautproben ex vivo durchgef{\"u}hrt wurde. Au{\"s}erdem wurde auf diese Weise ein Vergleich zwischen direkter Plasmabehandlung und UVStrahlung neben der unbehandelten Kontrolle m{\"o}glich. Dazu wurden aus den Hautproben nach Behandlung und anschlie{\"s}ender Inkubationszeit Kryoschnitte angefertigt. Um das enthaltene Melanin sichtbar zu machen, wurden die Schnitte einer Silbernitratf{\"a}rbung unterzogen. Die an einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommenen Bilder wurden anschlie{\"s}end mit Hilfe zweier Softwares ausgewertet und die Ergebnisse verglichen. Insgesamt l{\"a}sst sich trotz starker Schwankung der Ergebnisse beobachten, dass eine wiederholte direkte Plasmabehandlung eine Steigerung der Pigmentierung bewirkt, wenn auch in schw{\"a}cherem Ausma{\"s}, als dies nach UV-Bestrahlung zu beobachten ist. Insgesamt konnte durch Analyse des Melaningehaltes mit grundlegend unterschiedlichen Methoden wiederholt beobachtet werden, dass eine Plasmabehandlung einen geringen Effekt auf die Pigmentierung humaner Melanozyten aus{\"u}bt. Dieser Effekt ist bei Behandlungszeiten, wie sie f{\"u}r den kINPen®MED zur Wundbehandlung empfohlen sind, im Vergleich zu einer UVBestrahlung beziehungsweise im Vergleich mit einer pharmakologischen Induktion der Melanogenese deutlich niedriger. Eine Intensivierung der Pigmentierung im Rahmen einer Wundbehandlung ist demnach nicht zu erwarten. Nichtsdestotrotz {\"u}bt die Plasmabehandlung einen, wenn auch geringen, Effekt auf die Melaninproduktion in der humanen Haut aus. Um etwaige beteilige Enzyme an der gesteigerten Melaninproduktion zu erkennen, wurden Genexpressionsanalysen durchgef{\"u}hrt. Durch die Untersuchung der differenziellen Expression mittels Microarray konnte f{\"u}r 287 annotierte Gene eine {\"A}nderungen der Expression festgestellt werden, davon konnten 2 Gene identifiziert werden, f{\"u}r die ein Zusammenhang mit der Pigmentierung beschrieben ist. Ver{\"a}nderte Expressionslevel der haupts{\"a}chlich an der Melaninsynthese beteiligten Enzyme wurden durch die Plasmabehandlung der Melanozyten nicht detektiert. Die Untersuchung einiger ausgew{\"a}hlter, an der Melanogenese beteiligter Enzyme mittels qPCR f{\"u}hrte zum selben Ergebnis: durch die getesteten Parameter der indirekten Plasmabehandlung wurden keine biologisch relevanten {\"A}nderungen des Transkriptionslevels hervorgerufen. In der vorliegenden Arbeit wurde umfassend gezeigt, dass das Medizinprodukt kINPen®MED in den durchgef{\"u}hrten in vitro Tests einen vergleichsweise geringen Effekt auf die Pigmentierung aus{\"u}bt, der den Positivkontrollen unterlegen ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass der kINPen®MED keinen geeigneten Modulator der Pigmentierung darstellt. Gleichzeitig unterstreichen die Resultate die Unbedenklichkeit der sachgem{\"a}{\"s}en Anwendung des kINPen®MED an der humanen Haut hinsichtlich etwaiger Melanin-bedingter Ver{\"a}nderungen. Es ist weder eine sichtbare Verst{\"a}rkung der Pigmentierung noch eine Depigmentierung zu erwarten. Zudem wurde durch die Weiterentwicklung der Methodik im Bereich der Melaninanalytik ein Beitrag zur zuk{\"u}nftigen Testung von Pigmentierungsmodulatoren in Zellkulturmodellen geleistet.},
  language  = {de}
}