@phdthesis{Karkour2010,
  author    = {Anke Karkour},
  title     = {Pax6 und Pax6(5a) in pankreatischen β-Zellen},
  journal    = {Pax6 und Pax6(5a) in pancreatic β-cells},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000858-5},
  year      = {2010},
  abstract  = {In den pankreatischen α-Zellen ist Pax6 als Aktivator der Glucagon-Genexpression bekannt, w{\"a}hrend dessen Einfluss auf die Insulinsynthese kontrovers diskutiert wird. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, wie der Transkriptionsfaktor Pax6 und dessen co-exprimierte Isoform Pax6(5a) in den Insulin-produzierenden β-Zellen agieren, um so auf ihre Funktion in diesen Zellen schlie{\"s}en zu k{\"o}nnen. Mittels Luciferase-Assays, Northern Blots und Radioimmunoassays wurde gezeigt, dass Pax6 sowohl die Insulinsynthese als und auch die sezernierte Insulinmenge reduzieren kann, wobei die TAAT-Motiv-bindende Hom{\"o}odom{\"a}ne als essenziell f{\"u}r diesen Pax6-Effekt identifiziert wurde. Mit Hilfe fluoreszierender Fusionsproteine und der indirekten Immunfluoreszenz konnte beobachtet werden, dass der intrazellul{\"a}re Transport von Pax6 Glucose-abh{\"a}ngig erfolgt und zwar gegens{\"a}tzlich zu dem von PDX-1, einem Aktivator des Insulingens. So befand sich Pax6 bei Glucose-Mangel vor allem im Zellkern, bei hohen Glucose-Konzentrationen hingegen vorwiegend im Cytoplasma. BETA2, das synergistisch mit PDX-1 die Insulin-Genexpression induzieren kann, war Glucose-unabh{\"a}ngig stets im Zellkern lokalisiert. Die physiologische Relevanz der Translokation von Pax6 konnte in vivo durch die immunhistochemische Untersuchung von Pankreasschnitten normo- und hypoglyc{\"a}mischer C57BL/6 M{\"a}use best{\"a}tigt werden. GST-Capture-Assays zeigten die Interaktion von Pax6 und BETA2. Dar{\"u}ber hinaus demonstrierten CHIP-Assays in vivo eine gegens{\"a}tzliche Glucose-abh{\"a}ngige Bindung von Pax6 und PDX-1 an der ein TAAT-Motiv enthaltenden A3-Box des Ratten Insulin-II-Promotors und unterst{\"u}tzen damit die Hypothese von Pax6 als Inhibitor der Insulin-Genexpression. Das Serin 122 wurde in Pax6 als wichtige regulatorische Aminos{\"a}ure nachgewiesen, deren Mutation die Glucose-abh{\"a}ngige Translokation und die Wirkung von Pax6 auf den Ratten Insulin-II-Promotor stark beeinflusste. Wahrscheinlich wird diese Aminos{\"a}ure anders modifiziert, m{\"o}glicherweise glycosyliert. Eine Glycosylierung des Pax6-Wildtyps bei Glucose-Entzug wurde mittels Immunpr{\"a}zipitation von EGFP-Pax6 und anschlie{\"s}ender Western Blot-Analyse unter Verwendung eines O-GlcNAc-erkennenden RL2-Antik{\"o}rpers detektiert. So ist zu vermuten, dass bei Glucose-Mangel die Glycosylierung den Transport in den Kern vermittelt und die f{\"u}r den inhibitorischen Effekt von Pax6 auf die Insulin-Genexpression verantwortliche TAAT-bindende Hom{\"o}odom{\"a}ne beeinflusst. F{\"u}r Pax6 l{\"a}sst sich schlussfolgern, dass es sich bei geringer Glucose-Konzentration im Kern befindet, um die Aktivierung der Insulin-Genexpression zu verhindern, indem es mit BETA2 interagiert und die PDX-1-Bindungsstelle blockiert. Da Pax6 zus{\"a}tzlich unter diesen Bedingungen auch die Expression der f{\"u}r die β-Zelle spezifischen Gene aktiviert, um sie auf den zuk{\"u}nftigen Bedarf vorzubereiten, ist dessen essenzielle Rolle f{\"u}r die Aufrechterhaltung der β-Zellfunktion unumstritten. Ganz andere Effekte bewirkt hingegen die in den β-Zellen co-exprimierte Isoform Pax6(5a), die durch alternatives Splei{\"s}en des Exons 5a entsteht. Ihre Funktion in diesen Zellen war bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sie im Gegensatz zu Pax6 nicht an der Insulingen-Regulation beteiligt ist und auch nicht mit BETA2 interagiert. Analog zu Pax6 wurde ein Glucose-abh{\"a}ngiger Transport innerhalb der Zelle beobachtet. In vitro Kinase-Assays identifizierten in Pax6(5a) Threonin 48 als CKII-Phosphorylierungsstelle. Da es sich hierbei um die erste Aminos{\"a}ure des Exons 5a handelt, welche somit durch das alternative Splei{\"s}en in Pax6 nicht existiert, stellt diese Phosphorylierung eine spezifische Regulation dieser Isoform dar. Mittels fluoreszierender Fusionsproteine war zu beobachten, dass die Imitation dieser Phosphorylierung den Transport von Pax6(5a) in das Cytoplasma verhinderte. Das die CKII zahlreiche f{\"u}r Wachstum und Proliferation verantwortliche Faktoren reguliert, l{\"a}sst auf die Bedeutung der Pax6(5a)-Isoform in pankreatischen β-Zellen als Regulator des Wachstums f{\"u}r den Erhalt der β-Zellmasse schlie{\"s}en.},
  language  = {de}
}