@phdthesis{Bramsemann2010,
  author    = {G{\"o}tz Bramsemann},
  title     = {Expression thrombozyt{\"a}rer Antigene (Glykoprotein GP IIb/IIIa) in transgenen Pflanzenzellen},
  journal    = {Expression of platelet antigens (Glycoprotein GPIIb/IIIa) in transgenic plant cells},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000878-4},
  year      = {2010},
  abstract  = {Die Neonatale Alloimmunthrombozytopenie (NAIT) ist eine erworbene h{\"a}morrhagische Diathese durch thrombozyt{\"a}re Antik{\"o}rper. Die Immunisierung der Mutter findet nach {\"U}bertritt von kindlichen Thrombozyten bereits w{\"a}hrend der ersten Schwangerschaft statt. M{\"u}tterliche Anti-Thrombozyten-IgG-Antik{\"o}rper f{\"u}hren nach diaplazentarem {\"U}bertritt zu einem Abbau der kindlichen Pl{\"a}ttchen im retikulo-endothelialen System. 75\% aller F{\"a}lle von NAIT sind durch Anti-HPA1a-Antik{\"o}rper verursacht (HPA1a/b-Polymorphismus). Dieser Polymorphismus wird durch das GPIIIa-Gen des thrombozyt{\"a}ren GPIIb/IIIa-Rezeptors ausgebildet. Immunologische Toleranz ist die immunologische Hyposensibilit{\"a}t gegen{\"u}ber einem Antigen. Eine Form ist die orale Toleranz (OT), bei der es durch orale Zufuhr eines Antigens zu einer spezifischen Suppression der zellul{\"a}ren und humoralen Immunantwort kommt. Denkbar w{\"a}re auch eine immunologische Toleranz gegen{\"u}ber dem GPIIIa-Polymorphismus. Das Fernziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer transgenen zweikeimbl{\"a}ttrigen Pflanze (Tabak/Karotte) zur oralen Toleranzinduktion im Menschen gegen{\"u}ber dem HPA1a/b-Polymorphismus. Es wurde die Expression des humanen Glykoproteins GPIIIa in transgenem Tabak als Modellpflanzen systematisch untersucht. Die full-length cDNA von GPIIIa wurde schrittweise ver{\"a}ndert und sowohl als native humane Form und als Konstrukt mit ge{\"a}ndertem pflanzlichen Signalpeptid und einer R{\"u}ckhaltesequenz in Pflanzenzellenassays getestet (Protoplastierung). Als subzellul{\"a}re Kompartimente der Versuche dienten je nach Konstrukt das Zytosol oder das Endoplasmatische Retikulum der Pflanzenzelle. Die Protoplastenassays erbrachten keinen Nachweis eines rekombinanten Proteins mit GPIIIa-spezifischen mono- und polyklonalen Antik{\"o}rpern, ein RNA-Nachweis war methodisch nicht m{\"o}glich. Allerdings konnte die erfolgreiche Transformation durch ein fluoreszierendes Kontrollprotein (GFP) best{\"a}tigt werden. Schlie{\"s}lich wurde der HPA1a-Polymorphismus in einem Proteinfragment mit einer L{\"a}nge von 66 Aminos{\"a}uren in einem artifiziellen Gen rekonstruiert. Die Sequenz enthielt zus{\"a}tzlich einen optimierten Pflanzenpromotor, spezifische sekretorische Signal-, tag- und R{\"u}ckhaltepeptide und wurde in toto an die Pflanzenkodonusage angepasst. Mit dem Konstrukt wurde eine Tabakpflanzenlinie als Modell stabil transformiert. In den Pflanzen konnte die Integration und vollst{\"a}ndige Transkription des synthetischen Gens mit der RT-PCR nachgewiesen werden. Die transgenen Pflanzen wurden mit GPIIIa- und tag-spezifischen Antik{\"o}rpern mit unterschiedlichen Methoden (Western-Blot, ELISA) untersucht. Es wurden Versuchen zur Immunpr{\"a}zipitation und Rekonstitution der Disulfidbr{\"u}ckenstruktur im Epitop durchgef{\"u}hrt. In keiner Pflanze konnte rekombinantes GPIIIa-Epitop detektiert werden. Auch der Nachweis eines unreifen Proteins anhand des c-terminalen tag-Peptides gelang nicht. Auffallend war in den Tabakzellen eine starke Kreuzreaktion eines inerten Proteins mit polyklonalen GPIIIa-Antik{\"o}rpern auf H{\"o}he der Bande des humanen GPIIIa. Es ist denkbar, da{\"s} Tabakpflanzen bereits ein GPIIIa-{\"a}hnliches Protein ausbilden und bei der Synthese von artfremden humanen GPIIIa das unreife Protein einer Degradation unterziehen oder es zu einem Gene-silencing kommt.},
  language  = {de}
}