TY - THES U1 - Dissertation / Habilitation A1 - Bostedt, Linus T1 - Contributions of NP isoforms to the regulation of the Junín virus replication cycle and interactions with the host cell N2 - Coding constraints imposed by the very small genome sizes of negative-strand RNA viruses (NSVs) have led to the development of numerous strategies that increase viral protein diversity, enabling the virus to both establish a productive viral replication cycle and effectively control the host antiviral response. Arenaviruses are no exception to this, and previous findings have demonstrated that the nucleoprotein (NP) of the highly pathogenic Junín virus (JUNV) exists as three additional N-terminally truncated isoforms of 53 kD (NP53kD), 47 kD (NP47kD), and 40 kD (NP40kD). The two smaller isoforms (i.e. NP47kD and NP40kD) have been characterized as products of caspase cleavage, which appears to serve a decoy function to inhibit apoptosis induction. However, whether they have additional functions in the viral replication cycle remains unknown. Further, the origin and function of NP53kD has not yet been described. In order to first identify the mechanism responsible for production of the NP53kD variant, a possible role of additional caspase cleavage sites was first excluded using a site mutagenesis approach. Subsequently, alanine mutagenesis was then used to identify a region responsible for NP53kD production. As a result, three methionine residues were identified within the characterized sequence segment of NP, linking the production of NP53kD to an alternative in-frame translation initiation. Further site-directed mutagenesis of the previously identified putative in-frame methionine codons (i.e. M78, M80 and M100) finally led to the identification of translation initiation at M80 as being predominantly responsible for the production of NP53kD. Once the identity of all three NP isoforms was known, it was then of further interest to more deeply characterize their functional roles. Consistent with the N-terminal domain containing RNA binding and homotrimerization motifs that are relevant for the viral RNA synthesis process, it could be demonstrated that all three truncated NP isoforms lost the ability to support viral RNA synthesis in a minigenome assay. However, they also did not interfere with viral RNA synthesis by full-length NP, nor did they affect the ability of the matrix protein Z to inhibit viral RNA synthesis. Moreover, it was observed that loss of the oligomerization motifs in the N-terminus also affected the subcellular localization of all three NP isoforms, which were no longer localized in discrete perinuclear inclusion bodies, but rather showed a diffuse distribution throughout the cytoplasm, with the smallest isoform NP40kD also being able to enter the nucleus. Surprisingly, the 3'-5' exonuclease function of NP, which is associated with the C-terminal domain and plays a role in inhibiting interferon induction by digestion of double-stranded RNAs, was found to be retained only by the NP40kD isoform, despite that all three isoforms retained the associated domain. Finally, previous studies using transfected NP and chemical induction of apoptosis have suggested that cleavage of NP at the caspase motifs responsible for generating NP47kD and NP40kD plays a role in controlling activation of the apoptosis pathway. Therefore, to further characterize the connection between the generation of NP isoforms and the regulation of apoptosis in a viral context, recombinant JUNVs deficient in the respective isoforms were generated. Unlike infections with wild-type JUNV, mutations of the caspase cleavage sites resulted in the induction of caspases activation. Surprisingly, however, this was also the case for mutation of the alternate start codon responsible for NP53kD generation. Taken together, the data from this study suggest a model whereby JUNV generates a pool of smaller NP isoforms with a predominantly cytoplasmic distribution. As a result of this altered localization, NP53kD appears to be able to serve as the substrate for further generation of NP47kD and NP40kD by caspase cleavage. Not only does this cleavage inhibit apoptosis induction during JUNV infection, it also results in a cytoplasmic isoform of NP that retains strong 3'-5' exonuclease activity (i.e. NP40kD) and thus may play an important role in preventing viral double-stranded RNA accumulation in the cytoplasm, where it can lead to activation of IFN signaling. Overall, such results emphasize the relevance of alternative protein isoforms in virus biology, and particularly in regulation of the host response to infection. N2 - Die teils kleinen RNA Genome von Negativstrang-RNA-Viren (NSV) bedingen eine Einschränkung der Kodierungskapazität, was die Ausnutzung zahlreicher alternativer Strategien zur Proteinexpression notwendig macht, um so die virale Proteindiversität für einen produktiven viralen Replikationszyklus zu erhöhen. Gleichzeitig werden auf diese Art Proteine generiert, welche für die Kontrolle der Wirtszellantwort auf die Infektion notwendig sind. Auch für Arenaviren wurde die Nutzung dieser alternativen Strategien vermutet, da gezeigt werden konnte, dass das Nukleoprotein (NP) des hochpathogenen Junín-Virus (JUNV) in drei zusätzlichen N-Terminal verkürzten Isoformen von 53 kD (NP53kD), 47 kD (NP47kD) und 40 kD (NP40kD) vorliegt. Während die beiden kleineren Isoformen NP47kD und NP40kD als Produkte einer Caspase-abhängigen posttranslationalen Proteolyse charakterisiert wurden, konnte der Ursprung von NP53kD bisher nicht beschrieben werden. Für die Aufklärung des Ursprungs von NP53kD wurde zunächst eine auf der Basis von Pancaspase-Inhibitor Daten aufgestellte Hypothese überprüft, wonach NP53kD auch durch Caspasespaltung entsteht. Dies konnte aber durch eine Punktmutationsstudie von für die NP53kD Produktion in Frage kommenden Caspasespaltmotive nicht bestätigt werden. Stattdessen konnte NP53kD mit Hilfe eines Alanin Scan als Produkt von alternativer, in-frame Translationsinitiation beschrieben werden. Von den so identifizierten Methioninen (d.h. M78, M80 und M100) ließ sich mittels einer site- directed Mutagenese M80 als alternative Translationsstartstelle für die Produktion der größten NP Isoform darstellen. Ausgehend von der Struktur des Arenavirus NP aus einer N-terminalen Domäne, welche die für die virale RNA Synthese wichtigen RNA-Bindungs- und Homotrimerisierungsmotive kodiert, sowie einer C-terminalen Domäne, welche für die virale Regulierung der angeborenen Immunantwort wichtig ist, wurden die potenziellen funktionellen Eigenschaften der NP Isoformen untersucht. Da alle NP Isoformen Verkürzungen des N-Terminus aufweisen, welche zum Verlust von RNA-Bindungsstellen und/oder Coiled-Coil-Motiven führen, wurde der daraus resultierende Verlust der Proteinfunktion als Teil des viralen RNA-Syntheseprozesses mithilfe des, die virale RNA Synthese modellierenden Minigenomassays, nachgewiesen. Der Verlust dieser Motive innerhalb des N-Terminus von NP beeinflusst auch die subzelluläre Lokalisation der Isoformen, welche nicht, wie für das gesamte Protein beschrieben, in zytoplasmatischen Einschlusskörperchen vorliegen, sondern eine gleichmäßige Verteilung im Zytoplasma zeigen. Interessanterweise ließ sich für die NP40kD Variante auch eine zusätzliche Translokation in den Zellkern belegen. Folglich scheinen die Verkürzungen innerhalb des N-Terminus der Isoformen zur Bildung einer NP Subpopulation zu führen, welche nicht mehr Bestandteil des viralen RNA Syntheseprozesses ist und eine neue zelluläre Verteilung aufweist. Innerhalb der C-terminalen Domäne der Arenavirus NP wurde eine DEDDh 3'-5'-Exonuklease Domäne beschrieben, von der angenommen wird, dass sie eine Rolle bei der Modulierung der Interferon-Induktion während der Infektion spielt, indem zytoplasmatische Doppelstrang-RNA Spezies abgebaut werden. Mit Hilfe eines in vitro RNase-Aktivitätstests konnte gezeigt werden, dass die NP40kD Isoform als einzige eine Exonukleaseaktivität für doppelsträngige RNA (dsRNA) besitzt, welche mit der des gesamten NP vergleichbar ist. Dies könnte auf eine mögliche Rolle von NP40kD bei der viralen Kontrolle der Wirtsimmunantwort durch den Verdau von zytoplasmatischen viralen dsRNA Spezies hinweisen. Neben der Regulation der IFN-I Induktion konnte für hochpathogene Arenaviren wie JUNV die Kontrolle der Apoptoseinduktion als wichtigen Aspekt zur Verlängerung des viralen Replikationszyklus nachgewiesen werden. Frühere in-vitro Studien zeigten, dass die Spaltung von NP an den identifizierten Caspasemotiven 160DVKD163 (NP47kD) und 219QEHD222 (NP40kD) eine wichtige Rolle bei der Unterdrückung der Apoptoseinduktion spielen. Um den Zusammenhang zwischen NP53kD und NP47kD und NP40kD Produktion sowie die Bedeutung dieser alternativen Translations- und Caspasespaltstellen für den viralen Replikationszyklus weiter zu charakterisieren, wurden rekombinante JUNVs hergestellt, bei denen die alternative Tanslationsinitiationsstelle sowie die Caspasespaltmotive eliminiert wurden. Im Gegensatz zu Infektionen mit Wildtyp-JUNV, bei denen keine Caspaseaktivierung zu beobachten war, führten Mutationen der alternativen Translationsstarts sowie der Caspasespaltmotive zu einer Induktion der Caspaseaktivierung. Insgesamt unterstreicht dies die Bedeutung der NP Isoformen für die Kontrolle der Apoptose und belegt die Bedeutung des NP53kD als Hauptsubstrat, dessen Spaltung dann zur Bildung von NP47kD und NP40kD führt. Zusammenfassend beschreiben die Daten JUNV als erstes Beispiel der Arenaviridae, das neben der bereits beschriebenen NP Spaltung durch Caspasen in die NP47kD und NP40kD Isoformen auch nicht-kanonische alternative Translationsinitiation zur Bildung von NP53kD nutzt. Weiterhin stellt NP53kD ein virales Protein dar, welches anti-apoptotische Fähigkeiten besitzt, da NP53kD das Hauptsubstrat für aktivierte Caspasen darstellt und so die Aktivierung von Caspase-3 bei JUNV infizierten Zellen verhindert. Darüber hinaus erzeugt JUNV eine Subpopulation von verkürzten NP Versionen mit einer vorwiegend zytoplasmatischen Verteilung, von denen die kleinste Isoform NP40kD eine 3'-5'- Exonukleaseaktivität ähnlich dem Wildtyp NP zeigte. In Anbetracht der nachgewiesenen Lokalisierung von NP40kD im Zytoplasma und im Zellkern scheint NP40kD die virale Abwehrstrategie gegen die angeborene Immunantwort zu unterstützen. KW - Apoptose KW - Arenaviren KW - Proteinisoform KW - Alternative Translation KW - Pathogenität KW - Apoptosis KW - Arenavirus KW - Junín virus KW - Nucleoprotein KW - Proteinisoforms Y2 - 2022 U6 - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-78941 UN - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-78941 SP - 140 S1 - 140 ER -