@phdthesis{Wolf2011,
  author    = {Carmen Wolf},
  title     = {Charakterisierung von Staphylococcus aureus Isolaten aus bovinen Mastitisinfektionen und Analyse der oxidativen und nitrosativen Stressantwort},
  journal    = {Characterization of Staphylococcus aureus isolates from bovine mastitis infections and analysis of the oxidative and nitrosative stress response},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000912-6},
  year      = {2011},
  abstract  = {Staphylococcus aureus ist einer der bedeutendsten Erreger von Infektionen der Milchdr{\"u}se (Mastitis). In dieser Arbeit wurden 16 S. aureus-Isolate aus bovinen Mastitisinfektionen unterschiedlicher geografischer Herkunft umfassend charakterisiert, um tiefere Einblicke in die Wirtsspezifit{\"a}t von S. aureus zu erlangen. Das bovine Mastitisisolat S. aureus RF122, dessen Genomsequenz seit kurzem verf{\"u}gbar ist, wurde zum Vergleich in die Studien einbezogen. Mittels Multilocus Sequence Typing wurde die klonale Verwandtschaft der St{\"a}mme analysiert und ihre Zugeh{\"o}rigkeit zu bestimmten Sequenztypen bzw. klonalen Komplexen ermittelt, von denen einige unter bovinen S. aureus-Isolaten weltweit sehr verbreitet sind.Zum Nachweis von virulenz- und resistenzassoziierten Genen, sowie regulatorischen und speziesspezifischen Markergenen wurde ein diagnostischer DNA-Microarray eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass das individuelle Profil der Isolate sehr stark variierte und sich selbst St{\"a}mme mit dem gleichen Sequenztyp in ihrem variablen Genom teilweise erheblich unterschieden. Nur 43 Gene, die u.a. f{\"u}r H{\"a}molysine, Proteasen, Leukocidine kodieren, waren in allen St{\"a}mmen konserviert. Es wurde auch die Existenz einiger als bovin-spezifisch angesehener Gene, bzw. die Abwesenheit humanspezifischer Gene nachgewiesen. Zus{\"a}tzlich wurde die Expression von Virulenzfaktoren mittels 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrischer Identifizierung analysiert. Wie erwartet unterschieden sich die extrazellul{\"a}ren Proteommuster der einzelnen St{\"a}mme stark. Nur zw{\"o}lf sekretierte Proteine wurden (in unterschiedlicher Menge) von mindestens 80 \% der bovinen Isolate gebildet, und bilden das sogenannte „Core-Exoproteom“. Auch Isolate mit nahezu identischer genetischer Zusammensetzung unterschieden sich z.T. erheblich in ihrem Exoproteom, was sehr gut mit der Transkription des Virulenzgenregulators RNAIII korrelierte. Weiterhin wurde die mitogene Wirkung der Kultur{\"u}berst{\"a}nde auf humane und bovine PBMC (mononukle{\"a}re Zellen aus peripherem Blut) untersucht. Dabei fiel auf, dass zwei Isolate, welche Gene der bovinen Pathogenit{\"a}tsinsel SaPIbov trugen, bovine T-Zellen st{\"a}rker als humane stimulierten, was auf wirtsspezifische Unterschiede in der Aktivit{\"a}t dieser Superantigene hindeutet. Schlie{\"s}lich konnten durch den Vergleich mit S. aureus-Isolaten aus humanen Infektionen bestimmte Proteine ermittelt werden, die h{\"a}ufiger mit einem bestimmten Wirt assoziiert sind. Die Variabilit{\"a}t in der Expressionsh{\"a}ufigkeit dieser Proteine k{\"o}nnte mit der Wirtsspezifit{\"a}t von S. aureus im Zusammenhang stehen. Als pathogener Mikroorganismus ist S. aureus hohen Konzentrationen an reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (ROS und RNS) ausgesetzt, die im Rahmen der unspezifischen Wirts-Immunantwort gebildet werden. Um das Verst{\"a}ndnis {\"u}ber seine Anpassungsstrategien zu erweitern, wurden vier Substanzen, die oxidativen bzw. nitrosativen Stress verursachen, eingesetzt: Wasserstoffperoxid (H2O2), eine Vorstufe des stark toxischen Hydroxylradikals; Diamid, ein spezifisches Thiol-Oxidationsmittel, die Superoxidanion-generierende Substanz Paraquat, sowie der NO-Donor MAHMA NONOate. F{\"u}r jeden Stressor wurden Proteomsignaturen durch Auftrennung der cytoplasmatischen Proteine mittels 2D-Proteingelelektrophorese und anschlie{\"s}ender massenspektrometrischer Identifizierung erstellt. Die zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stressausl{\"o}sung neu synthetisierten Proteine wurden mittels L-[35S]-Methionin radioaktiv markiert und quantifiziert. Mindestens zweifach induzierte Proteine wurden als Markerproteine f{\"u}r einen bestimmten Stressor definiert. Durch Zugabe von 10 mM H2O2 wurden verst{\"a}rkt Proteine synthetisiert, die an Synthese, Reparatur oder Schutz von Nukleins{\"a}uren oder DNA beteiligt sind, was best{\"a}tigt, dass die DNA ein Hauptziel H2O2-induzierter Sch{\"a}digung ist. Unter Einfluss von 10 nM Paraquat wurden Proteine mit sehr unterschiedlichen biologischen Funktionen, wie z.B. Aminos{\"a}uresyntheseenzyme und Cofaktoren, induziert. Der durch 1 mM Diamid induzierte Thiolstress f{\"u}hrte wie erwartet zur verst{\"a}rkten Neusynthese CtsR und HrcA-kontrollierter Chaperone und Proteasen, was auf die Akkumulation fehlgefalteter Proteine hindeutet, die h{\"o}chstwahrscheinlich durch nichtnative Disulfidbr{\"u}cken an den Thiolgruppen der Cysteinreste entstanden sind. Die Induktion von Peroxiredoxinen und einer Thioredoxinreduktase lassen auf ein gest{\"o}rtes Redoxgleichgewicht in der Zelle schlie{\"s}en. Die Effekte von NO {\"a}hnelten denen, die auch unter Sauerstofflimitation beobachteten wurden. Viele Markerproteine sind in Glykolyse und Fermentation involviert und durch Nachweis der entsprechenden Fermentationsprodukte konnte eine h{\"o}here Aktivit{\"a}t fermentativer Stoffwechselwege best{\"a}tigt werden. Die F{\"a}higkeit, unter Einfluss von NO auf anaeroben Metabolismus umzuschalten, k{\"o}nnte ein entscheidender Vorteil von S. aureus und essentiell f{\"u}r seine h{\"o}here Resistenz gegen{\"u}ber NO sein.},
  language  = {de}
}