@phdthesis{Bischoff2017,
  author    = {Felix Bischoff},
  title     = {Identifizierung und Charakterisierung von drei Cutinasen der Hefe Arxula adeninivorans LS3 und deren Einsatz zum Abbau von Polyestern},
  journal    = {Identification and characterization of three new cutinases of Arxula adeninivorans LS3 and their application in the degradation of polyesters},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002834-7},
  year      = {2017},
  abstract  = {Die nicht-konventionelle, dimorphe, asexuelle und hemiascomycetale Hefe Blastobotrys (Arxula) adeninivorans wurde in den letzten Jahren in vielf{\"a}ltiger Weise eingesetzt und zahlreichen interessanten biotechnologischen Anwendungen unterzogen. Ein herausragendes Merkmal dieser Hefe ist das breite Substratspektrum, welches eine Vielzahl an Zuckern, Alkoholen sowie Purinen und Alkanen umfasst. In Folge der Genomsequenzierung des Stammes A. adeninivorans LS3 wurden drei putative Cutinase-Gene identifiziert. Cutinasen sind Serinhydrolasen, die in der Lage sind, Cutin der pflanzlichen Cuticula abzubauen. Dies erm{\"o}glicht es beispielsweise pflanzenpathogenen Pilzen wie Fusarium solani f. sp. pisi, die durch Cutin gesch{\"u}tzten Bereiche zu penetrieren, um in die Wirtspflanze einzudringen. Trotz der Isolation von A. adeninivorans St{\"a}mmen aus Holzhydrolysat in Sibirien sowie humusreichen B{\"o}den wurde diese Hefe bisher nicht als pflanzenpathogen beschrieben. Auch das Vorhandensein von Cutinasen oder Cutinase-{\"a}hnlichen Enzymen blieb bisher g{\"a}nzlich unbemerkt. Cutinasen sind f{\"u}r ein breites Spektrum an technischen Anwendungen zum Beispiel im Bereich des Abbaus und des Recyclings von bioabbaubaren Kunststoffen interessant. Aus diesem Grund wurden die drei Gene ACUT1, ACUT2 und ACUT3 aus dem Genom von A. adeninivorans LS3 isoliert. Mittels Homologie-Modellierung und Sequenzvergleich mit bekannten und charakterisierten Cutinasen konnten die α/β-Hydrolase Struktur, die katalytisch aktive S-D-H Triade mit dem in das G-Y-S-Q-G Motiv eingebetteten nucleophilen Serin, die Substratbindeschleife sowie die sogenannte „Flap-Helix“ identifiziert werden. Au{\"s}erdem wies Acut3p eine einzigartige C-terminale Glycin-Threonin-Serin reiche Sequenz (GTS-Sequenz) auf, die unabh{\"a}ngig von der katalytisch aktiven Dom{\"a}ne gefaltet ist. Unter Verwendung des Xplor®2 Transformations/Expressionssystems wurden rekombinante Varianten der drei putativen Cutinasen Acut1-6hp, Acut2-6hp und Acut3-6hp mit A. adeninivorans G1212 synthetisiert, im Kultur{\"u}berstand lokalisiert sowie {\"u}ber den 6xHistidin-Tag gereinigt. Die anschlie{\"s}ende biochemische Charakterisierung ergab ein nahezu uniformes Verhalten bez{\"u}glich pH-Optimum (pH 5,0 – 5,5) und Temperatur-Optimum (20 – 30 °C). Dar{\"u}ber hinaus wurde eine Instabilit{\"a}t der drei Cutinasen unter optimalen pH Bedingungen festgestellt. Diese konnte jedoch durch Zugabe von Osmolyten wie PEG200 vollst{\"a}ndig behoben werden. Das Substratspektrum wurde als entscheidender Parameter f{\"u}r die Einordnung der putativen Arxula-Cutinasen untersucht. Die h{\"o}chste Aktivit{\"a}t bei Substraten mit vier bis acht C-Atomen in der Acylkette entsprach dem Verhalten bereits bekannter Cutinasen. Weiterhin konnte der Abbau des Modellpolyesters Polycaprolacton sowie die Degradation von Apfelcutin erfolgreich durchgef{\"u}hrt werden, womit A. adeninivorans LS3 die erste ascomycetale Hefe mit nachgewiesenen cutinolytischen Enzymen ist. Zus{\"a}tzlich konnte die im Vergleich zu Acut1-6hp und Acut2-6hp erh{\"o}hte Temperaturstabilit{\"a}t von Acut3-6hp auf die GTS-Sequenz zur{\"u}ckgef{\"u}hrt werden. Als m{\"o}gliche Ursache f{\"u}r diesen Effekt wurde eine starke Glykosylierung der GTS-Sequenz angenommen. Durch {\"U}bertragung der GTS-Sequenz auf Acut1-6hp konnte die Temperaturstabilit{\"a}t dieses Enzyms erh{\"o}ht werden. Eine {\"U}bertragung auf die bereits stark glykosylierte Tannase 1 f{\"u}hrte dagegen nicht zu einer Erh{\"o}hung der Stabilit{\"a}t gegen{\"u}ber der Temperatur. Weiterhin wurden in zwei verschiedenen Fermentationsverfahren mit Fed-Batch-Betriebsweise bis zu 1.000.000 U L-1 (Acut2-6hp) im Medium akkumuliert. Dies stellte bereits einen ersten Hinweis auf das Potenzial f{\"u}r eine Anwendung im technischen Bereich dar. Dieses Potenzial konnte durch den erfolgreichen Abbau von Polyestern wie Polycaprolacton, Polybutylensuccinat, Polylactid, Poly[3-Hydroxybutyrat] sowie Poly[3-Hydroxybutyrat-Co-3-Hydroxyvalerat] verst{\"a}rkt werden. In weiteren Schritten m{\"u}ssen nun konkrete Anwendungsfelder f{\"u}r die in dieser Arbeit untersuchten Arxula-Cutinasen erschlossen werden. Der Abbau von real anfallenden Kunststoffabf{\"a}llen aus bioabbaubaren und nicht-abbaubaren Folien oder Beh{\"a}ltern sowie die R{\"u}ckgewinnung der aus der Hydrolyse erhaltenen Monomere sollten dabei {\"u}berpr{\"u}ft werden. Auf der anderen Seite w{\"a}re eine Anpassung der Kultivierungsmedien f{\"u}r die Gewinnung der Cutinasen im Pilot-Ma{\"s}stab angebracht, um eine Produktionskostenreduktion zu erreichen.},
  language  = {de}
}