@phdthesis{Junker2019,
  author    = {Sabryna Junker},
  title     = {Protein Arginine Phosphorylation in Staphylococcus aureus COL},
  journal    = {Protein Arginin Phosphorylierung in Staphylococcus aureus COL},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-33322},
  pages     = {131},
  year      = {2019},
  abstract  = {Reversible posttranslationelle Modifikationen spielen eine wichtige Rolle in der Regulation zentraler Prozesse in bakteriellen Zellen. Insbesondere die Phosphorylierung von Proteinen kann beispielsweise Signaltransduktionsprozesse beeinflussen und eine differenzierte Reaktion der Zelle auf Stress und Umweltbedingungen erm{\"o}glichen. So ist zum Beispiel der humanpathogene Organismus Staphylococcus aureus in der Lage, sich an die ver{\"a}nderten Bedingungen w{\"a}hrend der Besiedlung des menschlichen Wirtes anzupassen. Aus diesem Grund erm{\"o}glicht die Untersuchung von Phosphorylierungen in S. aureus ein besseres Verst{\"a}ndnis der Pathophysiologie und Virulenz dieses Organismus. Neben dem Wissen {\"u}ber relativ stabile Phosphorylierungen an den Aminos{\"a}uren Serin, Threonin und Tyrosin gewinnen dabei vor allem Erkenntnisse {\"u}ber energiereichere Phosphorylierungen, beispielsweise an Argininen, eine immer gr{\"o}{\"s}ere wissenschaftliche Aufmerksamkeit. Ein Ziel dieser Arbeit war es daher, Vorkommen und biologische Relevanz dieser Proteinmodifikation im globalen Ma{\"s}stab zu untersuchen. Es gelang in einem ersten Schritt, die Analyse dieser Modifikation methodisch zu optimieren und daraufhin acht Argininphosphorylierungen im Wildtyp S. aureus COL zu identifizieren. In einem zweiten Schritt wurde eine Deletionsmutante analysiert, deren fehlendes Gen ptpB f{\"u}r eine Argininphosphatase codiert. Die Charakterisierung dieses Enzyms in vitro bewies dessen Aktivit{\"a}t und Spezifit{\"a}t in Bezug auf Phosphorylierungen an Argininresten und erm{\"o}glichte im weiteren Verlauf die globale Analyse des Phosphoproteoms mit dem Fokus auf Argininphosphorylierungen. Neben der Optimierung der Phosphopeptidanreicherung als Teil der Probenvorbereitung wurde im Zuge dieser Analyse auch die Datenauswertung an die Herausforderungen der energiereichen Phosphorylierungen angepasst. Hierzu wurde die klassische Datenbanksuche um eine Analyse mittels Spektrenbibliotheken erweitert. Mittels synthetischer Peptide konnten qualitativ hochwertige Massenspektren generiert sowie die datenbankgest{\"u}tzten Auswerteverfahren zur Sicherstellung der Datenqualit{\"a}t der Spektrenbibliothek verifiziert werden. In einem weiteren Schritt wurde S. aureus COL in einer Vielzahl von Bedingungen kultiviert und die Analyse mehrerer subzellul{\"a}rer Fraktionen dazu genutzt, eine m{\"o}glichst gro{\"s}e Abdeckung des Proteoms zu erreichen. Die Kombination aus den Spektren der oben genannten synthetischen Peptide, den Spektren der unphosphorylierten Peptide aus den umfangreichen Kultivierungsans{\"a}tzen sowie den Spektren der angereicherten Phosphopeptide erm{\"o}glichte so schlussendlich die Konstruktion einer Spektrenbibliothek mit 2.270 Proteinen, von denen 392 an mindestens einem Peptid phosphoryliert sind. Ein Vergleich der datenbankgest{\"u}tzten Analyse mit der Analyse durch die erstellten Spektrenbibliotheken zeigte im weiteren Verlauf, dass f{\"u}r die Analyse von Argininphosphorylierungen die spektrenbibliotheksbasierte Analyse eindeutige Vorteile in Bezug auf die Reproduzierbarkeit innerhalb biologischer Replikate aufweist und somit eine zentrale Herausforderung in der Phosphoproteomik untersucht. Deswegen wurden diese Spektrenbibliotheken f{\"u}r eine Analyse des Phosphoproteoms von S. aureus unter Kontroll- und Stressbedingungen genutzt. So konnten in der Mutante 215 an einem Arginin phosphorylierte Peptide unter Kontrollbedingungen identifiziert werden und 117 nach oxidativem Stress. Der oxidative Stress wurde hierbei nach Wachstumsstudien zur ph{\"a}notypischen Charakterisierung der Mutante ausgew{\"a}hlt, da diese Bedingung nach oxidativem Stress die deutlichsten Ver{\"a}nderungen im Vergleich zum Wildtyp aufwies. Diese ph{\"a}notypischen Ver{\"a}nderungen konnten im letzten Teil dieser Arbeit auch quantitativ adressiert werden. Im Zuge einer Gesamtproteomquantifizierung von Wildtyp und Mutante unter Kontroll- und Stressbedingungen kristallisierte sich so ein Einfluss der ptpB Deletion auf den Aminos{\"a}urestoffwechsel, die oxidative Stressantwort und die Virulenz heraus. Die Quantifizierung von Phosphopeptiden mittels einer Kombination der spektrenbibliotheksbasierten Analyse mit einer Census-basierten Auswertung erm{\"o}glichte schlie{\"s}lich die Best{\"a}tigung der im Gesamtproteom gemachten Beobachtungen.},
  language  = {en}
}