@phdthesis{Wardenga2009,
  author    = {Rainer Wardenga},
  title     = {Rekombinante Expression und Design der Aminoacylase 1 f{\"u}r die Synthese von N-Acyl-Aminos{\"a}uren},
  journal    = {Recombinant expression and design of aminoacylase 1 for the synthesis of N-acyl-L-amino acids},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000617-5},
  year      = {2009},
  abstract  = {Im Rahmen der Dissertation wurde die M{\"o}glichkeit der enzymatischen N Acylierung von Aminos{\"a}uren {\"u}ber eine thermodynamisch kontrollierte Reaktion im w{\"a}ssrigen Medium untersucht. Eine Auswahl von Biokatalysatoren wurde auf ihre Eignung hin untersucht und die Aminoacylase 1 aus der Schweineniere (pAcy1) als Wildtyp-Enzym ausgew{\"a}hlt. Es konnte gezeigt werden, dass das prim{\"a}re Problem bei der pAcy1-katalysierten Synthese der Modellkomponente N-Lauroyl-L-Glutamat (NLLG) in einem sehr ung{\"u}nstigen thermodynamischen Gleichgewicht liegt. Dieses konnte zwar durch den pH-Wert zugunsten der Synthese verschoben werden, lieferte aber auch unter optimierten Bedingungen nur unzureichende Ums{\"a}tze. Als prim{\"a}re Probleme auf Seiten des Biokatalysators wurde ein niedriges Verh{\"a}ltnis zwischen der Synthese und Hydrolyse des Produktes (S/H-Verh{\"a}ltnis) neben einer vergleichsweise schlechten Akzeptanz langkettiger Acyldonoren identifiziert. Um f{\"u}r eine Optimierung des Enzyms die Methoden des rationalen Protein Designs und der gerichteten Evolution zu nutzen, wurde ein rekombinantes Expressionssystem {\"u}ber ein synthetisches Gen der pAcy1 auf dem Vektor pET52(b) realisiert. Durch die Anpassung des Expressionsmediums, der Temperatur sowie der Co-Expression molekularer Chaperone konnten etwa 80 mg aufgereinigtes Enzym pro Liter Fermentationsl{\"o}sung erhalten werden. Das rekombinante Protein wurde biochemisch charakterisiert und die Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber dem bevorzugten Substrat der pAcy1 N-Acetyl-L-Methionin (NAM) mit 94 U/mg quantifiziert. Die Optimierung des S/H-Verh{\"a}ltnisses der pAcy1 fokussierte sich auf das Potential der katalytischen Base (E146) zur Protonenaufnahme. Als Basis f{\"u}r ein rationales Design wurde ein Strukturmodell erstellt und ein Aspartat an der Position 346 identifiziert, welches den pKa-Wert von E146 ma{\"s}geblich beeinflusst. Durch Modellierungen der Elektrostatik im aktiven Zentrum wurde die Substitution von D346 zu Alanin, Asparagins{\"a}ure, Glutamat und Glutamin vorgeschlagen und weiterhin die Mutation der katalytischen Base selbst untersucht. Versuche zur Beschreibung des S/H-Verh{\"a}ltnisses von erstellten Varianten der pAcy1 wurden anschlie{\"s}end mit NAM als Modellkomponente durchgef{\"u}hrt. Bei allen Mutanten war ein starker R{\"u}ckgang der Gesamtaktivit{\"a}t zu verzeichnen, wobei die Restaktivit{\"a}ten der 146X-Varianten maximal 0,5\% und die der 346X-Varianten maximal 9\% bei der Hydrolyse betrugen. Durch die parallele Quantifizierung der Synthesereaktion konnte gezeigt werden, dass sich das S/H-Verh{\"a}ltnis durch die Substitution des Asp346 in beide Richtungen verschieben l{\"a}sst, wobei die gew{\"u}nschte Erh{\"o}hung des Verh{\"a}ltnisses mit einer stark verminderten Gesamtaktivit{\"a}t einhergeht. Die Mutante D346A wies z.B. eine Erh{\"o}hung des S/H-Verh{\"a}ltnisses von 0.02 auf 0.18 auf, wobei allerdings die Restaktivit{\"a}t im Vergleich zum Wildtyp-Enzym bei der Synthese 0.2\% und die in der Hydrolyse 0.05\% betrug. Zur Erkl{\"a}rung dieser Beobachtungen wurde die pH-Abh{\"a}ngigkeit der pAcy1-Varianten f{\"u}r die Hydrolyse des artifiziellen Substrats Furyl-Acyl-M ethionin (FAM) bestimmt. Eine Verschiebung des pH-Optimums ins Saure bzw. ins Basische korrelierte bei D346A bzw. D346E mit der zuvor bestimmten Verschiebung des S/H-Verh{\"a}ltnisses. Weiterhin sollte die Affinit{\"a}t der pAcy1 gegen{\"u}ber langkettiger Acyldonoren durch gerichtete Evolution erh{\"o}ht werden. Da aus der Literatur bekannt ist, dass die Reste I177, T345, L370 die Acylbindetasche des Enzyms definieren, wurden diese {\"u}ber iterative S{\"a}ttigungsmutagenese randomisiert und so etwa 32.000 Varianten der pAcy1 erzeugt. Zur Charakterisierung einer Mutantenbibliothek wurde ein hochdurchsatzf{\"a}higes Expressions- und Screeningsystem etabliert, wof{\"u}r das bereits realisierte Expressionssystem auf den Mikroliterma{\"s}stab {\"u}bertragen und auf die besonderen Anspr{\"u}che hin optimiert wurde. Zur Charakterisierung der Enzyme wurde eine modifizierte Form eines bereits beschriebenen Proteaseassays verwendet, welcher eine kontinuierliche Messung der entstehenden Aminos{\"a}ure als Produkt der Hydrolysereaktion erlaubte. Eine vorhergehende Selektion aktiver Varianten auf Minimalmedium erlaubt ein effizientes Screening der Mutantenbibliothek. Das Screening- und Selektionssystem wurde bisher mit der Wildtyp-pAcy1 und einer inaktiven Mutante erfolgreich getestet und zeigte Schwankungen von lediglich ±10\%. Das noch ausstehende Screening der Mutantenbibliothek wird in laufenden Arbeiten durchgef{\"u}hrt.},
  language  = {de}
}