@phdthesis{Huebner2018,
  author    = {Alexandra H{\"u}bner},
  title     = {Molekularbiologische Ans{\"a}tze zur Bek{\"a}mpfung der Afrikanischen Schweinepest},
  journal    = {Molecular biological approaches to combat African swine fever},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-25089},
  pages     = {113},
  year      = {2018},
  abstract  = {In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene grundlegende Ans{\"a}tze zur Pr{\"a}vention der Afrikanischen Schweinepest entwickelt und teilweise evaluiert. Die ersten beiden befassten sich mit der Impfstoffentwicklung, wobei einerseits eine vektorbasierte Strategie verfolgt und zum anderen auf eine attenuierte ASPV Lebendvakzine hingearbeitet wurde. Die dritte Herangehensweise war auf die Inhibierung der viralen Replikation in Schweinezellen mittels CRISPR/Cas9 fokussiert, um Hinweise auf die generelle Anwendbarkeit des Systems in transgenen Schweinen zu gewinnen. Der Pseudorabies-Virus Impfstamm Bartha (PrV-Ba) wurde als potenzieller Vektor f{\"u}r die Expression von ASPV-Antigenen im Schwein gew{\"a}hlt. Dazu wurde zun{\"a}chst eine Methode etabliert, mit der PrV-Rekombinanten effizient generiert werden konnten. Dabei erwies sich die Verwendung eines artifiziellen bakteriellen Chromosoms (BAC), welches das infekti{\"o}se PrV-Genom enthielt, als hilfreich. In diesem wurde ein essentielles PrV-Gen inaktiviert, dass dann durch homologe Rekombination mit einem Transferplasmid in co-transfizierten S{\"a}ugerzellen rekonstituiert werden konnte. Durch gleichzeitiges CRISPR/Cas9-vermitteltes Schneiden der BAC-DNA am gew{\"u}nschten Insertionsort konnte die Rekombinationsrate weiter gesteigert werden. Diese Strategie wurde anschlie{\"s}end f{\"u}r die Insertion verschiedener ASPV Gene in das PrV-Genom genutzt, wobei unterschiedliche Promotoren und Kodonoptimierungen getestet wurden. In den meisten F{\"a}llen konnten durch Verwendung des CAG-Promotors und eine Kodonadaptation an porcine Gene die h{\"o}chsten Expressionsraten erreicht werden. Somit wurde eine Methode entwickelt, mit der prinzipiell alle ASPV Gene im PrV Vektorsystem exprimiert und in Impfstudien getestet werden k{\"o}nnten. In der zweiten Untersuchung wurden zwei Proteine des ASPV mittels monospezifischer Antiseren n{\"a}her charakterisiert und ASPV-Deletionsmutanten generiert, um Hinweise auf die Funktionen der Proteine zu erhalten. Bei diesen Proteinen handelte es sich um p285L und pK145R. Sie wurden anhand von Daten aus einer vorhergehenden Proteomanalyse von Ke{\"s}ler et al. (2018) ausgew{\"a}hlt, da sie in gro{\"s}en Mengen in ASPV infizierten Zellen nachgewiesen wurden und deshalb wichtige Funktionen (beispielweise auch Virulenz-determinierende Funktionen) haben k{\"o}nnten. Bei p285L handelt es sich um ein fr{\"u}h exprimiertes Virionprotein, das zun{\"a}chst in den sogenannten Virusfabriken infizierter Wildschweinlungenzellen (WSL) akkumuliert. pK145R ist ein sp{\"a}tes ASPV Protein, das in Virionen nicht nachweisbar ist und eine diffuse Verteilung im Zytoplasma infizierter Zellen zeigt. Beide Proteine sind f{\"u}r die Virusreplikation nicht essentiell, und ihre Deletion f{\"u}hrte zu keiner (285L) oder einer nur m{\"a}{\"s}igen (K145R) Titerreduktion in infizierten WSL Zellen oder prim{\"a}ren Blutzellkulturen (PBMC). Durch in vivo Analysen der Deletionsmutanten muss nun gekl{\"a}rt werden, ob p285L und pK145R f{\"u}r die Virulenz bzw. die Wechselwirkung von ASPV mit dem Wirtsimmunsystem wichtig sind und ob sich die Mutanten deshalb als lebend attenuierte Impfstoffe eignen k{\"o}nnten. In der dritten Studie wurde untersucht, ob das CRISPR/Cas9 System zur Inhibition der ASPV Infektion in vitro geeignet ist. Dazu wurden WSL-Zelllinien generiert, die Cas9 und verschiedene sgRNAs konstitutiv exprimierten. Durch die Expression einer sgRNA gegen das Gen des ASPV Phosphoproteins p30 (CP204L) wurde die Virusreplikation nahezu komplett inhibiert. Die Spezifit{\"a}t des Effektes konnte durch parallele Versuche mit einem Virusisolat, dessen Zielsequenz nicht mit der genutzten sgRNA Sequenz {\"u}bereinstimmte, gezeigt werden. Dieses ASPV Isolat konnte im Gegensatz zum Virus mit der passenden Zielsequenz in den rekombinanten Zellen genauso gut replizieren, wie in nicht modifizierten Zellen. Zudem wurde die Spezifit{\"a}t durch die Analyse von sporadisch auftretenden Escape-Mutanten best{\"a}tigt, die verschiedene Basenaustausche in der Zielsequenz aufwiesen. Somit konnte gezeigt werden, dass das CRISPR/Cas9 System eine effiziente Inhibition der ASPV Replikation in Zellkultur bewirken kann und deshalb m{\"o}glicherweise auch in entsprechenden transgenen Schweinen eine Resistenz gegen letale ASPV-Infektionen vermitteln k{\"o}nnte. Zusammenfassend l{\"a}sst sich sagen, dass in allen drei Studien grundlegende Experimente erfolgreich durchgef{\"u}hrt wurden, die zur Pr{\"a}vention der Afrikanischen Schweinepest beitragen k{\"o}nnen.},
  language  = {de}
}