@phdthesis{Passvogel2015,
  author    = {Lars Simon Pa{\"s}vogel},
  title     = {Analyse funktioneller Dom{\"a}nen in den Kernfreisetzungskomplexproteinen pUL31 und pUL34 des Pseudorabies Virus},
  journal    = {Analysis of functional domains in the nuclear egress complex proteins pUL31 and pUL34 of Pseudorabies Virus},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002295-3},
  year      = {2015},
  abstract  = {W{\"a}hrend des Replikationszyklus der Herpesviren vermittelt ein heterodimerer Proteinkomplex, welcher als nuclear egress complex (NEC) bezeichnet wird, den Transport neu synthetisierter Nukleokapside vom Zellkern ins Zytoplasma. Ziel dieser Arbeit war es, die molekularen Grundlagen des viralen Kernaustritts weiter aufzukl{\"a}ren und funktionelle Dom{\"a}nen in den NEC-Komponenten, welche beim Pseudorabies Virus als pUL31 und pUL34 bezeichnet werden, zu ermitteln. Bereits durchgef{\"u}hrte Analysen konnten zeigen, dass die Transmembrandom{\"a}ne des pUL34, die f{\"u}r die Verankerung des NEC an der Kernmembran verantwortlich ist, bei HSV-1 und PrV durch heterologe Sequenzen ausgetauscht werden kann, ohne dass dabei die Proteinfunktion w{\"a}hrend des viralen Kernaustritts inhibiert wird. Beim PrV pUL34 kann sogar eine Substitution der 50 C-terminalen Aminos{\"a}uren toleriert werden, wohingegen die Substitution 100 C-terminaler Aminos{\"a}uren zum Funktionsverlust des Proteins f{\"u}hrt. Zur Identifikation m{\"o}glicher funktioneller Dom{\"a}nen im C-Terminus des PrV pUL34 wurde das Protein in der vorliegenden Arbeit zwischen 50 und 100 C-terminalen Aminos{\"a}uren schrittweise verk{\"u}rzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine Deletion von 85 C-terminale Aminos{\"a}uren keine Beeintr{\"a}chtigung der Proteinfunktion verursachte, wohingegen die weitere Deletion und Substitution von 90 Aminos{\"a}uren den viralen Kernaustritt blockierte. Somit konnte ein funktionell wichtiger Bereich des Proteins auf die Aminos{\"a}uren 172 bis 176 eingegrenzt werden. In dieser Region befindet sich die Sequenz 173RQR175, die einem RXR-Motiv entspricht, das als Signalsequenz f{\"u}r den Transport von Membranproteinen an die innere Kernmembran beschrieben wurde. Die in der vorliegenden Arbeit durchgef{\"u}hrte Analyse konnte jedoch zeigen, dass es sich hierbei um ein Arginin basierendes ER-Lokalisierungssignal handelt, welches die Anreicherung von Proteinen im endoplasmatische Retikulum (ER) und der damit verbundenen Kernmembran vermittelt. Neben der konservierten C-terminalen H{\"a}lfte des PrV pUL34 wurde in dieser Arbeit auch der N-Terminus analysiert. Bereits durchgef{\"u}hrte Studien beim PrV pUL34 ergaben dabei, dass die ersten 161 Aminos{\"a}uren f{\"u}r die Interaktion mit pUL31 und damit f{\"u}r die NEC-Bildung verantwortlich sind. In der vorliegenden Arbeit konnte die pUL31-Interaktionsdom{\"a}ne auf den Bereich von Aminos{\"a}ure 5 bis 161 eingegrenzt werden. Zur Analyse wichtiger Aminos{\"a}uren oder Motive innerhalb der Interaktionsdom{\"a}ne beim PrV pUL34 wurden in der vorliegenden Arbeit gezielt konservierte Aminos{\"a}uren zu Alanin ausgetauscht und die Auswirkungen auf die Bildung des NEC und der Funktion w{\"a}hrend einer Infektion analysiert. Dabei konnten zwei konservierte Motive identifiziert werden, die f{\"u}r die NEC-Bildung wichtig sind. Zum Einen wurde ein Motiv bestehend aus einer Glutamins{\"a}ure (E) und einem Tyrosin (Y) (EY-Motiv) detektiert, welches bereits in anderen pUL34-Homologen als essentiell f{\"u}r die Bildung eines funktionellen NEC beschrieben wurde. F{\"u}r ein zweites Motiv bestehend aus einem Asparagin (N), einem Threonin (T) und einem Glycin (G) (NTG-Motiv) zeigte sich, dass N und G f{\"u}r die Funktion des NEC wichtig sind. Zus{\"a}tzlich zu diesen beiden Motiven konnte ein konserviertes Asparagin an Position 103 identifiziert werden, welches zwar nicht f{\"u}r die Bildung des NEC ben{\"o}tigt wird, aber f{\"u}r die Funktion w{\"a}hrend des Kernaustritts essentiell ist. In dieser Arbeit wurde auch die zweite Komponente des NEC, das pUL31, untersucht. Dabei konnte die Funktion eines vorhergesagten Kernlokalisierungssignals (nuclear localization signal, NLS) im N-Terminus des Proteins best{\"a}tigt werden. Au{\"s}erdem wurde ein Kernexportsignal (nuclear export signal, NES) identifiziert, welches eine wichtige Rolle bei der Knospung der Nukleokapside an der inneren Kernmembran w{\"a}hrend des Kernaustritts spielt. Hierf{\"u}r wurden in dieser Studie die entsprechenden Bereiche im N- bzw. C-Terminus von pUL31 deletiert, was die Bildung eines funktionellen NEC und somit den Transport der Kapside aus dem Kern verhinderte. Ausgehend von vorherigen Untersuchungen am PrV pUL31, kann dabei spekuliert werden, dass der Bereich des NLS im N-Terminus neben der Lokalisierung im Zellkern m{\"o}glicherweise auch f{\"u}r eine Funktion bei der Oligomerisierung von NECs bzw. pUL31-Molek{\"u}len wichtig ist. Der Bereich im C-Terminus, welcher das NES beinhaltet, scheint hingegen f{\"u}r die Komplexbildung mit pUL34 relevant zu sein. Zusammenfassend f{\"u}hrten die hier durchgef{\"u}hrten Analysen in den beiden NEC-Komponenten pUL31 und pUL34 zu einem besseren Verst{\"a}ndnis der molekularen Grundlagen des herpesviralen Kernaustritts. Da es bisher noch nicht gelungen ist eine Kristallstruktur des NEC zu ermitteln, sind Mutagenesestudien eine wichtige Methode funktionelle Dom{\"a}nen zu identifizieren. Die Aufkl{\"a}rung der NEC-Struktur kann in Kombination mit den bereits durchgef{\"u}hrten Mutagenesestudien das Verst{\"a}ndnis der Funktion dieses Komplexes weiter komplettieren.},
  language  = {de}
}