@phdthesis{Goetze2020, author = {Daniel G{\"o}tze}, title = {Optimierung industriell-relevanter Bacillus-Spezies}, journal = {Optimization of industrial relevant Bacillus species}, url = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-38302}, pages = {157}, year = {2020}, abstract = {Vertreter der Gattung Bacillus werden nicht zuletzt wegen ihrer guten Sekretionsleistung als Expressionswirte in der pharmazeutischen und chemischen Industrie genutzt und stellen eine Alternative zum gramnegativen Bakterium Escherichia coli, Hefepilzen und anderen Organismen dar. Die Art B. licheniformis ist besonders f{\"u}r die Proteaseproduktion geeignet, w{\"a}hrend B. subtilis zus{\"a}tzlich als Produktionswirt f{\"u}r die industrielle Herstellung von Wirk- und Zusatzstoffen wie Bacitracin und Riboflavin verwendet wird. Das Genom beider Arten wurde vollst{\"a}ndig sequenziert und erm{\"o}glicht die Analyse einzelner Gene und deren Funktionen. Um die Effizienz von industriellen Fermentationsprozessen zu erh{\"o}hen, k{\"o}nnen verschiedene genetische Modifikationen hilfreich sein. So kann beispielsweise die Deletion einzelner Gene bzw. Gencluster als auch die heterologe Expression bestimmter Gene zu einer Weiterentwicklung eines Produktionsstammes beitragen und die Vorteile mehrerer St{\"a}mme in einem vereinen. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit beinhaltet u. a. die Erstellung eines optimierten Wirtssystems. Im Mittelpunkt der dazu durchgef{\"u}hrten Untersuchungen zu B. subtilis standen verschiedene Enzyme des Acetoinstoffwechsels. Es konnte anhand der {\"U}berexpression der homologen Xylanase XynA gezeigt werden, dass die Deletion des Operons acoABCL in B. subtilis 6051HGW zu einer verbesserten Autoinduktion des acoA-Promotors f{\"u}hrt. Durch einen alsDS-knock out hingegen wird diese verringert. Eine verbesserte Acetoinproduktion des Stammes B. subtilis 6051HGW konnte durch die Expression einer zweiten Kopie der Gene der beiden Untereinheiten einer Acetolactat-Synthase (IlvBH) erreicht werden. Zudem wurde w{\"a}hrend der station{\"a}ren Phase ein verbessertes Wachstumsverhalten dieser Mutante auf Minimalmedium beobachtet. Weiterhin wurde das Gen einer putativen Diacetyl-Reduktase aus dem Stamm B. subtilis TU-B-10 untersucht. Dieses Enzym k{\"o}nnte f{\"u}r die Reduktion des nichtenzymatisch entstandenen Metaboliten Diacetyl zu Acetoin verantwortlich sein. Nach Integration des entsprechenden Gens in B. subtilis 6051HGW war jedoch keine erh{\"o}hte Acetoinkonzentration im Kultur{\"u}ber- stand zu messen. B. subtilis 6051HGW LS8PD zeichnet sich u. a. durch seine 8-fache Proteasedefizienz aus. Anhand zweier Modellenzyme wurde die Eignung des Stammes als Expressionswirt heterologer Proteine untersucht. Mit Hilfe eines simulierten fed-batch-Verfahrens konnte das aus dem eukaryotischen Wirt S. cerevisiae stammende Gen sOx in B. subtilis 6051HGW LS8PD erfolgreich exprimiert und in den {\"U}berstand sekretiert werden. Nach Expression des Gens einer DnaseI aus Bos taurus konnte das entsprechende Protein extrazellul{\"a}r dagegen nicht nachgewiesen werden. Andere Untersuchungen, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgef{\"u}hrt wurden, besch{\"a}ftigten sich mit dem Glyoxylatstoffwechsel von B. subtilis 6051HGW. Die Gene des Glyoxylatzyklus sind nicht im Genom von B. subtilis enthalten. Werden sie aus B. licheniformis in B. subtilis6051HGW transferiert, kann der generierte Stamm B. subtilis ACE {\"U}berflussmetabolite wie Acetoin oder Acetat f{\"u}r das Wachstum nutzen. Dabei reichert sich jedoch extrazellul{\"a}r der Metabolit Glycolat an, was m{\"o}glicherweise zu einer Beeintr{\"a}chtigung des Glyoxylatzyklus f{\"u}hren kann. Da die Akkumulation von Glycolat in B. licheniformis nicht erfolgt, wurde vermutet, dass die Aktivit{\"a}t der putativen Glyoxylat-Reduktase GyaR daf{\"u}r verantwortlich ist. F{\"u}r weitere genetische Modifikationen von B. subtilis ACE war eine Neukonstruktion des Stammes erforderlich. Ein anschlie{\"s}ender Transfer des Gens gyaR in B. subtilis konnte die extrazellul{\"a}re Glycolatkonzentration jedoch nicht senken. Auch die Deletion von gyaR in B. licheniformis f{\"u}hrte nicht zu h{\"o}heren Konzentrationen dieses Metaboliten. Es kann geschlussfolgert werden, dass das untersuchte Gen gyaR nicht f{\"u}r eine Glyoxylat-Reduktase codiert. Weitere Untersuchungen besch{\"a}ftigten sich mit der Zellheterogenit{\"a}t von B. licheniformis P300. Das Auftreten von Subpopulationen in einer Bakterienkultur kann zu einem unterschiedlichen Verhalten der einzelnen Zellen und einer verringerten Gesamteffizienz in Produktions- prozessen f{\"u}hren. In Zellkulturen des Stammes B. licheniformis P300 konnten verschiedene Subpopulationen identifiziert werden. Um die genetische Zug{\"a}nglichkeit zu optimieren, wurden verschiedene Untersuchungen zur nat{\"u}rlichen Kompetenz von B. licheniformis P300 durchgef{\"u}hrt. Zur Vereinheitlichung der w{\"a}hrend der Kultivierung des Stammes auftretenden Subpopulationen wurden sigD- und sipW-tasA-yqxM-Deletionsmutanten erstellt. Zur Stammkonstruktion kam ein Verfahren zur Anwendung, das clean deletions im Genom erzeugte. Das Protokoll der Kolonie-PCR zur Identifizierung von potentiellen Deletanten wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit optimiert. Die generierten Mutanten zeigten im Gegensatz zum Wildtypstamm keine sigD-vermittelte Motilit{\"a}t und Chemotaxis sowie keine tasA-vermittelte Biofilmbildung. Nach Auftrennung der Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation wurden die auftretenden Banden mit denen des Wildtyps verglichen. Dabei zeigte sich, dass eine Deletion von sigD zur Vereinheitlichung der Subpopulationen f{\"u}hrt. Die generierte Mutante wies weiterhin ein verbessertes Wachstum als der Wildtyp und einen ver{\"a}nderten Ph{\"a}notyp auf, zeigte aber eine verringerte Effizienz bei der Transformation von DNA durch Elektroporation.}, language = {de} }