@phdthesis{Kromrey2016,
  author    = {Marie-Luise Kromrey},
  title     = {Die Funktion des MRP4 (ABCC4)-Transporters in Thrombozyten: Bedeutung von Adaptorproteinen},
  journal    = {Functioning of MRP4 (ABCC4) Transporter in Platelets: Influence of Adaptor Proteins},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002500-4},
  year      = {2016},
  abstract  = {Das Multidrug Resistance Protein 4 (MRP4/ABCC4) ist als Mitglied der ABC-Transporterfamilie nicht nur an dem Transport zahlreicher Pharmaka, wie beispielsweise antiviraler und zytostatischer Substanzen, sondern auch an Signaltransduktionsprozessen, z.B. dem Transport von Eicosanoiden und zyklischen Nukleotiden beteiligt. MRP4 weist au{\"s}erdem innerhalb der ABCC-Gruppe ein einmaliges Expression-, Lokalisations- und Substratspektrum auf. MRP4 wurde neben Prostata, Niere, Gehirn und Leber auch in Blutpl{\"a}ttchen nachgewiesen und kann zelltypabh{\"a}ngig sowohl apikal oder basolateral als auch intrazellul{\"a}r lokalisiert sein. Insbesondere das Vorkommen in den δ-Granula der Thrombozyten ist bemerkenswert, da die Speicherung und Freisetzung von {\"U}bertr{\"a}gersubstanzen wie ADP auf die Thrombozytenfunktion entscheidenden Einfluss haben. {\"A}nderungen der zelltypischen MRP4-Lokalisation, die beispielsweise bei Patienten mit δ-storage pool Defekt beobachtet wurden, k{\"o}nnen zu einem Verlust der spezifischen Transporterfunktion f{\"u}hren. Das Ziel dieser Arbeit war es, das Transportprotein Multidrug resistance protein 4 in Bezug auf Protein-Protein-Wechselwirkungen genauer zu untersuchen. Da die Lokalisation von Membranproteinen u.a. durch die Wechselwirkung mit Proteinen gesteuert wird, stand die Identifikation m{\"o}glicher Interaktionspartner von MRP4 mit Hilfe von Bindungs- und Kolokalisationsstudien im Vordergrund dieser Arbeit. Es schien sehr wahrscheinlich, dass Adaptormolek{\"u}le {\"u}ber eine Wechselwirkung mit MRP4 an dessen trafficking innerhalb der Zellen beteiligt sind und damit Einfluss auf dessen Lokalisation und konsekutiv auch auf die Funktion nehmen. Als m{\"o}gliche Motive zur Vermittlung solcher Proteinbindungen liegen im MRP4-Molek{\"u}l ein PDZ-Motiv sowie eine m{\"o}gliche Bindungsstelle f{\"u}r Adaptorprotein (AP)-Komplexe vor. Zur Ermittlung solcher potentiellen Partner wurde eine Affinit{\"a}tschromatographie durchgef{\"u}hrt. Daf{\"u}r erfolgte die Kopplung eines Peptids, welches der C-terminalen Sequenz von MRP4 mit dem PDZ-Bindemotiv entsprach, an eine Sepharosematrix und eine anschlie{\"s}ende Inkubation mit Thrombozytenlysat. Mittels Western Blot-Verfahren und Fl{\"u}ssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie konnten im gewonnenen Eluat das ERM-bindende Phosphoprotein 50 (EBP50/NHERF1), Moesin, sowie das Post synaptic density protein 95 (PSD95) und das Hitzeschockprotein Hsp90 als m{\"o}gliche Bindungspartner identifiziert werden. W{\"a}hrend eine Wechselwirkung von MRP4 mit EBP50 {\"u}ber seine PDZ-Dom{\"a}ne bereits postuliert worden war, konnten insbesondere PSD95 und Hsp90 erstmalig als m{\"o}gliche Interaktionspartner von MRP4 ermittelt werden. Da PSD95 bisher vorwiegend in neuronalen Zellen beschrieben wurde, wurde das Vorkommen dieses Proteins in Thrombozyten und der megakaryoblastischen Leuk{\"a}miezelllinie M-07e auf RNA-Ebene untersucht und nachgewiesen. Damit konnte erstmals die Expression dieses scaffolding Proteins in Zellen der myeloischen Reihe gezeigt werden. Im Anschluss daran wurden Kof{\"a}rbungen von MRP4 und den identifizierten Bindungspartnern durchgef{\"u}hrt. Die indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie lieferte das Ergebnis einer zumindest partiellen Kolokalisation des Transporters mit Hsp90 – in Thrombozyten und M-07e-Zellen in intrazellul{\"a}ren Strukturen, in den Nierenepithelzellen LLC-PK1 und MDCKII in der Plasmamembran. Auch eine Kolokalisation von MRP4 mit PSD95 konnte in M-07e-Zellen und Thrombozyten beobachtet werden. Untersuchungen mit dem Hsp90-Hemmstoff Radicicol ergaben des Weiteren zum einen eine sichtbare Verringerung der MRP4-Expression im Western Blot nach der Inkubation, zum anderen auch eine {\"A}nderung der Lokalisation von Hsp90 und MRP4 in den verwendeten Nierenzelllinien nach intrazellul{\"a}r. Ferner konnten funktionelle Transportversuche unter Verwendung von inside-out Thrombozytenmembranvesikeln einen Abfall der Aufnahme des radioaktiv markierten MRP4-Substrats cGMP in die Vesikel nach Behandlung mit Radicicol zeigen. Um den Einfluss von PSD95 auf die MRP4-Lokalisation zu untersuchen, wurde ein spezifischer knock-down von PSD95 mittels siRNA in M-07e-Zellen durchgef{\"u}hrt. Im Anschluss ergab sich in der Immunfluoreszenzmikroskopie eine deutliche Zunahme der MRP4-Lokalisation in der Plasmamembran. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit EBP50, Moesin, PSD95 und Hsp90 als m{\"o}gliche Bindungspartner von MRP4 in Thrombozyten identifiziert werden. Es ist denkbar, dass Hsp90 als Hitzeschockprotein m{\"o}glicherweise zu der Prozessierung und Stabilisierung von MRP4 beitr{\"a}gt. Die Interaktion mit PSD95 hingegen scheint die Internalisierung des Transportproteins zu beg{\"u}nstigen. Die gewonnenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass Protein-Protein-Interaktionen die Lokalisation und Funktion von MRP4 entscheidend beeinflussen.},
  language  = {de}
}