@phdthesis{Kumpfmueller2014,
  author    = {Jana Kumpfm{\"u}ller},
  title     = {Heterologe Produktion des Polyketids 6-Desoxyerythronolid B und des nichtribosomalen Peptids Enniatin B in Bacillus subtilis},
  journal    = {Heterologous production of the polyketide 6-deoxyerythronolide B and of the nonribosomal peptide enniatin B in Bacillus subtilis},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002063-2},
  year      = {2014},
  abstract  = {Nat{\"u}rliche Metabolite sind Ausgangsstoff f{\"u}r eine Reihe von Arzneimitteln wie zum Beispiel Antibiotika. Doch bis zur Anwendung am Menschen sind viele Analyseschritte notwendig. Da viele Naturstoffe nicht in ausreichenden Mengen zur Verf{\"u}gung gestellt werden k{\"o}nnen, wird deren Funktionsanalyse und Anwendung erschwert. F{\"u}r dieses Defizit sind im Wesentlichen zwei Ursachen zu nennen. Entweder ist eine Vielzahl der Produzenten nicht kultivierbar oder eine ausreichende Synthese ist unter Laborbedingungen im Ausgangsstamm nicht m{\"o}glich. Aus diesem Grund sind alternative Strategien wie zum Beispiel eine heterologe Expression dieser Synthese-Cluster in geeigneten Wirten notwendig. Dies war der Ansatzpunkt f{\"u}r die vorliegende Arbeit. Eine besondere Bedeutung innerhalb der Naturstoffe kommt der strukturell diversen und mitunter sehr komplexen Gruppe der Polyketide und nichtribosomalen Peptide zu, die oft pharmazeutisch relevante Wirkungen aufweisen. Die f{\"u}r ihre Synthese verantwortlichen Enzyme (PKS und NRPS) sind h{\"a}ufig beachtliche Multienzymkomplexe, die durch Gencluster codiert werden, deren Gr{\"o}{\"s}e von 10–100 kbp reichen kann. Bisher wurden f{\"u}r die heterologe Produktion dieser Metabolite in erster Linie Actinomyceten wie zum Beispiel Streptomyces coelicolor und Myxococcus xanthus, die selbst eine Vielzahl an Polyketiden und nichtribosomalen Peptiden synthetisieren, oder Escherichia coli genutzt. In der vorliegenden Arbeit wurde Bacillus subtilis, der bereits breite Anwendung in der industriellen Herstellung von technischen und pharmazeutischen Proteinen findet, erstmals als heterologer Wirt f{\"u}r die Synthese eines Polyketids (6-Desoxyerythronolid B) und eines nichtribosomalen Peptids (Enniatin B) eingesetzt. Zu diesem Zweck wurde ein Klonierungsprotokoll f{\"u}r die schnelle und wiederholte Genommodifizierung entwickelt. Dieses basiert auf der Kombination von transformationssteigernden Elementen (sogenannten six-sites) mit der chromosomalen Integration einer induzierbaren Kopie des Kompetenzfaktors ComS. Zur Markerentfernung wurde das Cre-lox-System implementiert. Durch die zus{\"a}tzliche Deletion des Restriktions- und Modifikationssystems wurde eine weitere Voraussetzung zur chromosomalen Integration gro{\"s}er Gencluster geschaffen. Damit steht nun ein optimiertes Protokoll f{\"u}r die Konstruktion von B. subtilis-Expressionsst{\"a}mmen und deren weiterer genomischer Modifizierung zur Verf{\"u}gung. Als Vertreter einer komplexen Polyketidsynthase wurde die Desoxyerythronolid B-Synthase (DEBS) aus Saccharopolyspora erythraea ausgew{\"a}hlt. Dieser aus drei ca. 300–350 kDa gro{\"s}en Proteinen (DEBS1–3) bestehende Enzymkomplex ist f{\"u}r die Bildung des Makrolids 6-Desoxyerythronolid B (6dEB) verantwortlich, das die Vorstufe des antibiotisch wirksamen Erythromycins darstellt. Das korrespondierende Gencluster umfasst drei ca. 10 kb gro{\"s}e Gene (eryAI–III) und konnte erfolgreich in drei Operonstrukturen im Genom von B. subtilis lokalisiert werden: als i) nat{\"u}rliches Operon, ii) modifiziertes Operon mit optimierten RBS und iii) drei separate Expressionskassetten. Unter fed-batch-simulierenden Bedingungen (EnBase-System) gelang dabei ein positiver Metabolitennachweis f{\"u}r den Stamm mit drei separaten Expressionskassetten. Um das Zellwachstum und die 6dEB-Synthese zu verbessern, wurden weiterf{\"u}hrende Genommodifizierungen des Produktionsstammes vorgenommen, von denen sich einige positiv auf die Produktbildung auswirkten. Mit diesem Versuch wurde erstmals die prinzipielle Eignung von B. subtilis als heterologer Produzent f{\"u}r komplexe Polyketide erbracht. Die Enniatin-Synthetase (ESyn) aus dem filament{\"o}sen Pilz Fusarium oxysporum wurde als Beispiel einer nichtribosomalen Peptidsynthetase in die Arbeit einbezogen. Aufgrund der handhabaren Gr{\"o}{\"s}e des esyn-Gens (10 kb) wurde die Expression auf single- und multi-copy-Level untersucht. Dabei wurde auch der Einfluss verschiedener Genommodifizierungen und {\"A}nderungen in den Wachstumsbedingungen auf die Produktbildung analysiert. Die Kultivierungsversuche inklusive Metabolitenanalyse wurden in Kooperation mit dem Institut f{\"u}r Biologische Chemie an der TU Berlin durchgef{\"u}hrt. Abschlie{\"s}ende Konzentrationen des entsprechenden Metaboliten (Enniatin B), einem zyklischen Hexadepsipetid mit zahlreichen antiinfektiven Wirkungen, wurden auf 4,5 µg/L (single-copy) bzw. 1,2mg/L (multi-copy) beziffert. Damit konnte in B. subtilis zum ersten Mal die heterologe Produktion eines gattungsfremden nichtribosomalen Peptids demonstriert werden. Zusammengefasst beschreibt die pr{\"a}sentierte Arbeit die erfolgreiche Produktion eines komplexen Polyketids und eines nichtribosomalen Peptids. Obwohl weitere Untersuchungen notwendig sind, um einige unerwartete Effekte bestimmter Genommodifizierungen aufzukl{\"a}ren und eine weitere Steigerung in der Produktausbeute zu erreichen, konnte eindeutig belegt werden, dass sich B. subtilis als Wirt f{\"u}r die heterologe Produktion von Sekund{\"a}rmetaboliten eignet.},
  language  = {de}
}