@phdthesis{Jochens2010,
  author    = {Helge Jochens},
  title     = {Neue Konzepte f{\"u}r das Protein-Engineering am Beispiel von Enzymen mit alpha/beta-Hydrolasefaltung},
  journal    = {New concepts for protein engineering - the example of alpha/beta-hydrolase fold enzymes},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000743-5},
  year      = {2010},
  abstract  = {Trotz einer sehr gro{\"s}en funktionellen Diversit{\"a}t, zeichnen sich die Enzyme innerhalb der α/β-Hydrolasefaltung-Superfamilie durch eine sehr hohe strukturelle Homologie aus, weshalb man annimmt, dass sich deren Vertreter {\"u}ber divergente Evolution aus einem gemeinsamen Vorfahren entwickelt haben. Unter Zuhilfenahme von Methoden des Protein-Engineerings sollte im ersten Teil der Arbeit untersucht werden, ob es m{\"o}glich ist, Enzyme innerhalb dieser Superfamilie ineinander umzuwandeln. Als Modelenzyme dienten eine Esterase aus Pseudomonas fluorescens (PFE) und eine Epoxidhydrolase aus Agrobacterium radiobacter (EchA). Nach der Etablierung geeigneter Analysemethoden f{\"u}r Esteraseaktivit{\"a}t und Epoxidhydrolaseaktivit{\"a}t wurden mittels verschiedener Sequenz- und Strukturalignments Aminos{\"a}uren identifiziert, die essentiell f{\"u}r den jeweiligen Reaktionsmechanismus sind. Diese wurden nachfolgend mittels positionsgerichteter Mutagenese in die jeweiligen Enzyme eingef{\"u}gt und die entsprechenden Mutanten auf die jeweilige Aktivit{\"a}t hin untersucht. Leider zeigte weder die PFE Epoxidhydrolaseaktivit{\"a}t, noch die EchA Esteraseaktivit{\"a}t. Anschlie{\"s}end wurden {\"u}ber weitere Strukturvergleiche ganze Bereiche in Epoxidhydrolasen identifiziert, die m{\"o}glicherweise von Wichtigkeit f{\"u}r die Funktionalit{\"a}t des Enzyms sind. Es wurden also ganze Bereiche der PFE durch solche der EchA ersetzt und auf diese Weise drei Chim{\"a}r-Enzyme hergestellt. Diese Chim{\"a}ren wurden mittels Coexpression von Chaperonen hergestellt und anschlie{\"s}end aufgereinigt. Eines dieser Chim{\"a}renzyme zeigte eindeutig Epoxidhydrolaseaktivit{\"a}t. Es wird angenommen, dass der Eingangsbereich ins aktive Zentrum der PFE im Wildtyp-Enzym versperrt war und dieser durch den Austausch eines Loops ge{\"o}ffnet wurde. Weiterhin wurde ein Ansatz entwickelt, Esteraseaktivit{\"a}t in der EchA zu generieren. Dieser basiert auf einem strukturbasierten Sequenzalignment, das es erlaubt Aminos{\"a}uren zu identifizieren, die sich in Epoxidhydrolasen und Esterasen unterscheiden. Leider f{\"u}hrte dieser Ansatz bisher noch nicht zum Erfolg, weshalb weitere Untersuchungen n{\"o}tig sind. Im zweiten Teil der Arbeit ging es darum, Mutantenbibliotheken f{\"u}r die fokussierte, gerichtete Evolution m{\"o}glichst klein, aber qualitativ hochwertig herzustellen. Zu diesem Zweck wurde ebenfalls ein strukturbasiertes multiples Sequenzalignment herangezogen, das es erlaubt die Aminos{\"a}ureverteilung an verschiedenen Positionen des Enzyms in einer riesigen Anzahl strukturell verwandter Enzyme zu bestimmen. Auf diese Weise kann ermittelt werden, welche Aminos{\"a}uren an definierten Positionen sehr h{\"a}ufig sind und welche eher selten. Von solchen Resten, die sehr selten sind, wird angenommen, dass sie negative Auswirkungen auf die strukturelle Integrit{\"a}t des Proteins haben und deshalb von der Natur nicht ber{\"u}cksichtigt wurden. Diese Annahme wurde zur Herstellung von Proteinbibliotheken ausgenutzt. In einer fokussierten, gerichteten Evolution wurden einmal 3 und einmal 4 Aminos{\"a}uren der PFE simultan und zuf{\"a}llig durch Aminos{\"a}uren ersetzt, die sehr h{\"a}ufig in 2800 verwandten Sequenzen an diesen Positionen vorkommen. Die auf diese Weise generierten Bibliotheken wurden einmal auf eine verbesserte Thermostabilit{\"a}t (f{\"u}r die 3 Positionen) und einmal auf eine verbesserte Enantioselektivit{\"a}t untersucht (4 Positionen). Hierbei wurde zus{\"a}tzlich die Auswirkung der Mutationen auf die Substratspezifit{\"a}t untersucht. Als Vergleichsbibliotheken wurden ebenfalls einmal alle 20 proteinogenen Aminos{\"a}uren eingef{\"u}gt und einmal nur solche, die sehr selten im Alignment auftauchen. Das Ergebnis war in beiden F{\"a}llen eine sehr viel bessere Bibliothek, wenn nur solche Reste vertreten waren, die auch in der Natur bevorzugt vorkommen. Dies galt sowohl in Bezug auf die Anzahl aktiver Klone in jeder Bibliothek, als auch auf die Chance eine verbesserte Variante zu finden (stabiler bzw. selektiver). Die besten Mutanten der Bibliotheken hatten im Vergleich zum Wildtyp einen 8°C h{\"o}heren Schmelzpunkt bzw. einen bis 18fach h{\"o}heren E-Wert (bei 50facher katalytischer Effizienz). Weiterhin konnten die Substratspezifit{\"a}t um den Faktor 4.300 ver{\"a}ndert werden.},
  language  = {de}
}