@phdthesis{Foerster2014,
  author    = {Sarah Foerster},
  title     = {Identifizierung differentieller Interaktionsmuster des Epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors in Abh{\"a}ngigkeit von Arzneistoffresistenz und Rezeptorgenetik},
  journal    = {Identification of differential interaction patterns of the epidermal growth factor receptor depending of medical resistence and receptor genetics},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001761-8},
  year      = {2014},
  abstract  = {Ein Netzwerk aus Rezeptoren und Signalkaskaden reguliert Wachstum, Differenzierung und {\"U}berleben von Zellen. Wird dieses Netzwerk aus dem Gleichgewicht gebracht, k{\"o}nnen die Zellen zu Tumorzellen transformieren. Der epidermale Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) stellt eine treibende Kraft in diesem Netzwerk dar und ist ein Ziel zahlreicher Tumortherapeutika. Aufgrund weitl{\"a}ufiger Resistenzbildung ist die Identifizierung verantwortlicher Strukturen von gro{\"s}er Bedeutung um die entarteten Signalkaskaden synergistisch einzud{\"a}mmen. Nach Aktivierung des EGFR wird eine signalspezifische Antwort durch Rekrutierung von Adapterproteinen an die intrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne initiiert. Die ver{\"a}nderte Zusammensetzung der Signalproteine k{\"o}nnte Angriffspunkte f{\"u}r neue Therapieans{\"a}tze enth{\"u}llen. Um die zugrundeliegenden Mechanismen zu entschl{\"u}sseln, wurden mehrere Proteom-Untersuchungen auf Zelllysate angewendet. Ungeachtet der Sensitivit{\"a}t moderner Ger{\"a}te stellt die Identifizierung niedrig-abundanter Proteine im Proteom einer Zelle jedoch eine Herausforderung dar. Die Identifizierung differentieller Proteinmuster des EGFR-Interaktom in Abh{\"a}ngigkeit von Resistenz und Rezeptor variante war das Ziel dieser Arbeit. Der EGFR samt seiner Interaktionspartner wurde aus Zelllysaten pr{\"a}zipitiert. Anschlie{\"s}end wurden die Proteine in einer SDS-PAGE aufgetrennt und nach in-Gel-Verdau mit LC-MS/MS analysiert. Aus Lysaten von A431-Zellen wurden 183 Proteine in vier Bioreplikaten detektiert. Darunter 15 direkte Interaktionspartner, wie GRB2, SHC1, SOS1/2, STAT1/3, AP2 sowie P85B. Die Berechnung des normalized spectral abundance factor (NSAF) anhand der Anzahl gemessener Spektren und der Molekularmasse eines Proteins erm{\"o}glichte eine relative Quantifizierung der Proteinmenge. Die Menge der copr{\"a}zipitierten Proteine war nach EGFR-Aktivierung durch EGF f{\"u}r 14 Proteine mehr als zweifach erh{\"o}ht. Davon waren Untereinheiten des AP2 Komplexes am st{\"a}rksten an aktivierten EGFR assoziiert. Abschlie{\"s}end wurde die Interaktion mit AP2 und die neu aufgedeckte Interaktion mit CIP2A durch Immunfluoreszenz und Western Blot-Analyse best{\"a}tigt. Nachdem die Funktionalit{\"a}t der Methode gezeigt werden konnte, wurde die Anwendung um das Modell einer akuten Afatinib-Resistenz erweitert. Im A431-Zellmodell wurde durch die Inkubation in Fibroblasten-konditioniertem Medium eine Resistenz gegen Afatinib beobachtet. Im Rahmen dieser Arbeit sollte ermittelt werden, ob sich der Einfluss der tempor{\"a}ren Resistenz am Interaktionsmuster des EGFR widerspiegelt. Die MS-Analyse identifizierte 145 Proteine deren Assoziation an EGFR durch Afatinib mindestens zweifach verringert wurde, darunter GRB2, SOS1, SHC1, STAT2/3 sowie PK3CB und P85B. Aus dieser Analyse wurde ein Pool aus 137 Proteinen ermittelt, die potentiell Teil des induzierten Resistenzmechanismus sein k{\"o}nnten. 32 Proteine, darunter TNAP2, AHNK, SPTCS und der Tumorsuppressor DIDO, weisen funktionelle {\"A}hnlichkeit zu Lungenkrebs auf. Daraufhin wurde die Methode auf das Modell einer chronisch erworbenen Resistenz der Lungenkarzinom-Zelllinie HCC4006 gegen Erlotinib angewendet. Die Analyse sollte zun{\"a}chst differentielle Proteinmuster des Grundzustandes in Abh{\"a}ngigkeit zur erworbenen Resistenz identifizieren. Die Morphologie der Erlotinib-resistenten HCC4006-Zellen weist Merkmale einer EMT auf, die als Resistenzmechanismus f{\"u}r verschiedene Tumore beschrieben ist. Im Einklang mit dieser Beobachtung wurden Hinweise auf rege Ver{\"a}nderungen des Zytoskeletts in der vorliegenden MS-Analyse der resistenten HCC4006-Zellen gefunden. In unbehandelten Zellen wurden abh{\"a}ngig vom Resistenz-Status der Zellen 178 Proteine mit mindestens zweifach ver{\"a}nderter Assoziation an EGFR detektiert. Darunter fanden sich die Proteine der Zytoskelettreorganisation Plectin, Spectrin und ZO1, welche in resistenten Zellen bis zu 70 fach erh{\"o}ht waren. Das Angiogenese-Protein Nostrin ist hingegen nach Resistenzentwicklung stark vermindert. Nach Behandlung mit Erlotinib und EGF war die Assoziation von 148 Proteinen durch Erlotinib Resistenz ver{\"a}ndert. Darunter befanden sich HEAT1, EF1A1, UBS3B und AP3B1 die in sensitiven Zellen durch Erlotinib st{\"a}rker dissoziierten als in den resistenten Zellen. Abschlie{\"s}end wurde die differentielle Analyse auf zwei EGFR VarianteIII (vIII) transfizierte Glioblastomzelllinien {\"u}bertragen. In den P3-Zellen sind 95 Proteine in Abh{\"a}ngigkeit der Rezeptorvariante zweifach ver{\"a}ndert an EGFR assoziiert. Darunter waren JAK1, GRB2, PRKDC und SNX-3, 17 und 27 vermehrt an vIII assoziiert, wohingegen PHB2 bevorzugt an Wildtyp-EGFR assoziiert. In den NCH421k Glioblastomzellen ist die Affinit{\"a}t f{\"u}r vIII bei 245 Proteinen zweifach ver{\"a}ndert. Darunter die Phosphokinasen P85A und P85B mit stark erh{\"o}hter vIII-Affinit{\"a}t. F{\"u}r vIII ist eine bevorzugte Initiierung des PI3K/AKT Signalweges, sowie eine konstitutive Aktivit{\"a}t bereits beschrieben. Mit dem Abschluss dieser Arbeit liegt ein Protokoll zur differentiellen Analyse der EGFR Interaktionsmuster vor},
  language  = {de}
}