@phdthesis{Korpis2014, author = {Katharina Korpis}, title = {Apoptose und Autophagozytose in Krebszellen: Mechanismen des Zelltodes, verursacht durch Sigma-Rezeptor-Liganden und photoaktivierbare Pt(IV)-Komplexe}, journal = {Apoptosis and autophagy in cancer cells: cell death mechanisms caused by sigma-receptor-ligands and photoactivatable Pt(IV)-complexes}, url = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001783-6}, year = {2014}, abstract = {In der vorliegenden Arbeit sollten zwei verschiedene Wirkstoffklassen auf ihre F{\"a}higkeit Apoptose und Autophagozytose zu aktivieren analysiert werden. Dabei wurden 39 Sigma-Rezeptor-Liganden, die an der Universit{\"a}t M{\"u}nster (Arbeitsgruppe von Prof. Bernhard W{\"u}nsch) synthetisiert wurden, zun{\"a}chst auf ihre antiproliferativen Eigenschaften in acht humanen Krebszelllinien untersucht. Anhand der Struktur-Wirkungs-Beziehungen konnte gezeigt werden, dass sich gro{\"s}e, raumf{\"u}llende Substituenten an beiden N-Atomen des Piperazin-Grundger{\"u}stes positiv auf die Hemmung des Zellwachstums auswirken. Da die Multiple Myelom Zellinie RPMI 8226 eine hohe Dichte an Sigma-Rezeptoren exprimiert, wurde sie f{\"u}r weitere Versuche herangezogen. Als repr{\"a}sentative Liganden wurde das Enantiomerenpaar (S)-11 und (R)-11 f{\"u}r weitere Versuche ausgew{\"a}hlt, da es neben einer guten Affinit{\"a}t zu beiden Rezeptor-Subtypen auch antiproliferierende Eigenschaften in der RPMI 8226-Zelllinie zeigte. Die Behandlung f{\"u}hrte zur zeitabh{\"a}ngigen Induktion der Apoptose, die mit den typischen Charakteristika wie morphologische Membranausst{\"u}lpungen, Annexin-V positive Zellen und der Chromatinkondensation einherging. Die Detektion von aktivierter Caspase-3, -8 und -9 im Durchflusszytometer deutete zun{\"a}chst auf eine Beteiligung beider Signalwege der Apoptose hin. Da im Western Blot keine Caspase-9-Spaltprodukte detektiert werden konnten und auch die Vorinkubation mit den Caspase-Inhibitoren z-VAD-FMK und M50054 keinen Effekt auf die Apoptoserate bewirkte, scheinen die Caspasen im Sigma-Ligand-vermittelten Zelltod eine untergeordnete Rolle einzunehmen. Die fr{\"u}he Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials verbunden mit der zunehmenden Konzentration des Apoptose-induzierenden Faktors (AIF) im Zytosol der RPMI 8226-Zellen deuten ebenfalls auf eine Caspase-unabh{\"a}ngige Form der Apoptose hin, die besonders f{\"u}r Sigma(2)-Agonisten bereits beschrieben ist. Und auch in diesem Projekt zeigen die Sigma-Liganden zytotoxische Aktivit{\"a}ten, wenn sie eine Affinit{\"a}t zum Sigma(2)-Rezeptor aufweisen. Neben der Apoptose konnten (S)-11 und (R)-11 auch die Autophagozytose induzieren. Dieser Prozess scheint jedoch der Apoptose nachgeschaltet zu sein und weist darauf hin, dass es sich nicht um einen Schutzmechanismus der Zelle handelt, sondern eher in einer direkten Form des programmierten Zelltodes vom Typ II begr{\"u}ndet ist. Dieser ist bisher noch nicht f{\"u}r Sigma-Rezeptor-Liganden beschrieben und k{\"o}nnte einen Vorteil gegen{\"u}ber anderen Vertretern dieser Wirkstoffklasse darstellen. Eine Gemeinsamkeit von Sigma-Ligand-induzierter Apoptose und Autophagozytose liegt in ihrer Aktivierung durch die Lipidperoxidation. Es wurde ein sehr fr{\"u}her Anstieg von LPO-Produkten detektiert, der sich nur durch das lipophile Antioxidans alpha-Tocopherol beeinflussen lie{\"s}. Desweiteren konnte die antiproliferierende Wirkung von (S)- 11 und (R)-11 im MTT-Assay komplett blockiert werden, und auch die Apoptoseraten wurden durch den Radikalf{\"a}nger signifikant erniedrigt. Die Hemmung der LC3-II-Expression im Western Blot durch alpha-Tocopherol verdeutlicht auch hier die Beteiligung der LPO an der Autophagozytose. Als Vertreter einer weiteren Wirkstoffklasse wurde der phtoaktivierbare Pt(IV)-Komplex FM 165, der in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Peter Sadler (Universit{\"a}t Warwick, UK) synthetisiert wurde, untersucht. Die antiproliferierenden Eigenschaften der photoaktivierbaren Pt(IV)-Verbindung k{\"o}nnen nicht mit der Apoptose als Zelltodmechanismus begr{\"u}ndet werden. In diesem Fall lie{\"s}en sich keine morphologischen Charakteristika nachweisen und auch die Annexin-V Anf{\"a}rbung fiel negativ aus. Die weiteren Untersuchungen zeigten jedoch auch die Aktivierung der Autophagozytose durch Expression von LC3-II und p62 im Western Blot. Eine Hemmung lysosomaler Enzyme durch die Protease-Inhibitoren E64d und Pepstatin A f{\"u}hrte zu erh{\"o}hten LC3-II-Konzentrationen sowie einer p62-Akkumulation. Im Gegensatz zu den Sigma-Rezeptor-Liganden deutet dies eher auf eine vollst{\"a}ndige Verlaufsform hin. Da die Autophagozytose bereits nach 6 h-Behandlung mit FM 165 detektiert wurde, ist es nicht ausgeschlossen, dass es sich zun{\"a}chst um eine zellsch{\"u}tzende Funktion handeln k{\"o}nnte. Auch beim FM 165 scheinen oxidative Vorg{\"a}nge eine wichtige Rolle hinsichtlich der Autophagozytose-Aktivierung zu {\"u}bernehmen. Nach erfolgter Photoaktivierung der Zellen lie{\"s}en sich ansteigende ROS Konzentrationen verzeichnen, die nach 2 h deutlich wurden und somit noch vor der Autophagozytose entstehen.}, language = {de} }