@phdthesis{Doelken2006,
  author    = {Marc D{\"o}lken},
  title     = {Etablierung einer quantitativen, allel-spezifischen \"real-time\" PCR f{\"u}r rearrangierte Immunglobulingene des IgH-Locus maligner B-Zell Lymphome},
  journal    = {keine Angaben},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-200406-6},
  year      = {2006},
  abstract  = {In der vorliegenden Arbeit konnte bei 55 Patienten mit B-Non-Hodgkin-Lymphomen (B-NHL) der maligne B-Zellklon mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) nachgewiesen werden: bei 41 Patienten mit chronisch lymphatischer Leuk{\"a}mie (CLL), 6 mit Mantelzell-Lymphom (MCL), 4 mit follikul{\"a}rem Lymphom (FL) und bei je einem Patienten mit Haarzell-Leuk{\"a}mie (HCL), hoch-malignem B-NHL, lymphoplasmozytoidem Immunozytom (LP-1Z) und Plasmozytom. F{\"u}r die Etablierung einer quantitativen, Klon-spezifischen (Allel-spezifischen) \"real-time\" PCR f{\"u}r die rekombinierten VDJ-Gene des IgH-Locus der malignen B-Zellen wurde die CLL gew{\"a}hlt, da bei dieser Erkrankung eine exzessive Vermehrung eines B-Zellklons vorliegt und - im Vergleich zu hochmalignen NHL und vor allem dem Plasmozytom - relativ selten erhebliche Mutationen im VH-FR3-Bereich auftreten. F{\"u}r die Identifizierung des VDJ-Rearrangements des jeweiligen Patientenklons wurde in der prim{\"a}ren PCR als 3´ Primer ein Oligonukleotid komplement{\"a}r zu einem konservierten Abschnitt aller sechs JH-Segmente in Kombination mit einem von sechs verschiedenen 5´ Primern komplement{\"a}r zu den konservierten Abschnitten der sechs VH-Familien-spezifischen VH-FR3-Regionen verwendet. Zus{\"a}tzlich wurden sechs VH-Familienspezifische DNA-Sonden eingesetzt. Als Positivkontrolle wurde ein Moniertes k-ras DNA-Fragment als Standard verwendet. Alle PCR-Amplifikate (VH1-VH6) wurden auf ein Agarosegel aufgetragen. In fast allen F{\"a}llen fanden wir im Fall einer VH-Familienspezifischen Reaktion eine positive Reaktion in der \"real-time\" PCR und ein erwartetes DNA-Fragment von 100-200 Basenpaaren (bp). Bei 31/55 Patienten (21 CLL, 5 MCL, 2 FL, l HCL, l cb-NHL, l Plasmozytom) wurde das in der prim{\"a}ren PCR identifizierte IgH-Rearrangement des malignen Zellklons sequenziert. Die ermittelten Sequenzen wurden mit ver{\"o}ffentlichten Sequenzen aus der Genbank \"Igblast - Blast for Nucleotide Sequences\" des \"National Center for Biotechnology Information\" (NCBF) zur Bestimmung der VH-N-D-N-JH {\"U}bergangsregionen verglichen. Wie in der Literatur bei der CLL beschrieben, fanden wir ein bevorzugtes Rearrangement der Gene VH l-69, VH3-30, VH3-33 und VH4-34. Im Anschluss an die Sequenzierung des jeweiligen malignen B-Zellklons wurden f{\"u}r die quantitative, Klon-spezifische PCR-Analyse Allel-spezifische Oligonukleotid-Primer (ASO-Primer) aus der VH-N-D-N-JH {\"U}bergangsregion ausgew{\"a}hlt. Die Spezifit{\"a}t des jeweiligen 3' ASO-Primers f{\"u}r ein bestimmtes Rearrangement wurde an zellul{\"a}rer DNA mit Hilfe der PCR analysiert. Die ausgew{\"a}hlten ASO-Primer wurden vor dem weiteren Einsatz in der Klon-spezifischen PCR f{\"u}r den einzelnen Patienten an positiven und, wenn m{\"o}glich, an morphologisch/zytologisch negativen Remissionskontrollen des Patienten, DNA Pr{\"a}parationen von f{\"u}nf anderen CLL Patienten und f{\"u}nf PBMNC (\"peripheral blood mononuclear cells\") gesunder Spender getestet. F{\"u}r die Quantifizierung der eingesetzten zellul{\"a}ren DNA diente eine quantitative \"real-time\" PCR f{\"u}r k-ras. Bei 8/21 sequenzierten CLL-Patienten wurden Verlaufskontrollen mit Hilfe der Allel-spezifischen, quantitativen \"real-time\" PCR (ASO-PCR) f{\"u}r das klonale VDJ-Rearrangement des IgH-Locus durchgef{\"u}hrt. Die Methode wurde dann bei weiteren 8 Patienten mit verschiedenen B-NHL (4 MCL, 2 FL, l HCL, l hoch-malignes NHL) erfolgreich zur Verlaufskontrolle unter Chemotherapie z.T. in Kombination mit dem monoklonalen Antik{\"o}rper Rituximab®, sowie nach autologer bzw. allogener Blutstammzell-Transplantation eingesetzt. Ziel war u.a. die {\"U}berwachung residualer Leuk{\"a}mie- bzw. Lymphomzellen (\"minimal residual disease\" = MRD). Bei zwei der im Rahmen dieser Arbeit allogen transplantierten Patienten mit MCL und HCL war es mit Hilfe der quantitativen ASO-PCR m{\"o}glich, fr{\"u}hzeitig eine Therapie des molekularen Relapses (Anstieg peripherer zirkulierender Lymphomzellen {\"u}ber mehr als 3 log Einheiten) durch eine erneute Gabe des monoklonalen Antik{\"o}rpers Rituximab® und durch Reduktion bzw. Wegnahme der Immunsuppression (Ausnutzung des immunologischen Effektes \"Graft-versus-Leukemia\" - GvL) einzuleiten. So konnte bei beiden Patienten der molekulare Relaps erfolgreich behandelt und ein klinischer Relaps verhindert werden. Zusammenfassend l{\"a}sst sich festellen, dass die Allel-spezifische, quantitative \"real-time\" PCR (ASO-PCR) hervorragend geeignet ist, den malignen B-Zellklon bei verschiedenen B-NHL auch in der Phase der kompletten klinisch-zytologischen Remission zu verfolgen und damit eine Hilfe f{\"u}r differenziertere Therapieentscheidungen in die Hand zu bekommen.},
  language  = {de}
}