@phdthesis{Karner2010,
  author    = {Susanne Karner},
  title     = {Aufkl{\"a}rung zugrunde liegender Ursachen f{\"u}r die interindividuelle Variabilit{\"a}t von Expression und Funktion der Nukleosid Diphosphat Kinase (NDPK) beim Menschen},
  journal    = {Elucidation of underlying mechanisms for the interindividual variability of expression/function of human nucleoside diphosphate kinase (NDPK)},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000832-0},
  year      = {2010},
  abstract  = {Azathioprin und 6-Mercaptopurin sind wichtige Arzneimittel in der Therapie onkologischer und inflammatorischer Erkrankungen. Die Wirksamkeit dieser Medikamente ist im Wesentlichen von der Bildung aktiver Metabolite, sog. Thioguaninnukleotide (TGN), abh{\"a}ngig. Diese sind die Summe von Thioguanosinmonophosphat (TGMP), Thioguanosindiphosphat (TGDP) und Thioguanosintriphosphat (TGTP). Im Jahr 2005 wurde erstmals berichtet, dass das Ansprechen der Thiopurintherapie bei Patienten mit chronisch-entz{\"u}ndlichen Darmerkrankungen vom Verh{\"a}ltnis der Metabolite Thioguanosindiphosphat (TGDP) zu Thioguanosintriphosphat (TGTP) abh{\"a}ngt (Neurath et al. Clin Gastroenterol Hepatol. 2005 Oct;3(10):1007-14). Es wird angenommen, dass die Konversion von TGDP zu TGTP durch das ubiquit{\"a}r exprimierte Enzym Nukleosid Diphosphat Kinase (NDPK) katalysiert wird. Die interindividuelle Variabilit{\"a}t der humanen NDPK-Expression bzw. -Funktion und deren Bedeutung f{\"u}r den Thiopurinmetabolismus sind bisher nicht systematisch untersucht worden. Daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit, zuerst den Nachweis zu f{\"u}hren, dass die Konversion von TGDP zu TGTP durch die NDPK katalysiert wird. Im Anschluss daran erfolgte eine systematische Analyse der interindividuellen Variabilit{\"a}t der relevanten NDPK-Isoformen, NDPK A und NDPK B, in verschiedenen humanen Geweben (Leber und Blutzellen). Dabei sollte auch der Einfluss von genetischen, nicht genetischen sowie epigenetischen Faktoren auf die Variabilit{\"a}t der NDPK-Expression untersucht werden. Daf{\"u}r wurden zun{\"a}chst die NDPK-Isoformen NDPK A und NDPK B rekombinant exprimiert und ein high performance liquid chromatographie (HPLC)-Assay zur Bestimmung der NDPK-Aktivit{\"a}t etabliert. Die Quantifizierung der NDPK-Expression auf mRNA- und Proteinebene wurde mit Hilfe von quantitativer real-time PCR bzw. durch indirekte Immunodetektion der Isoformen mit spezifischen Antik{\"o}rpern durchgef{\"u}hrt. Um den Einfluss von genetischen und epigenetischen Faktoren auf die NDPK A bzw. B Expression zu untersuchen, wurden die Genbereiche von NDPK A (NME1) und NDPK B (NME2) sequenziert bzw. mittels Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analysiert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, die beiden NDPK-Isoformen NDPK A und NDPK B in E.coli rekombinant zu exprimieren. Mithilfe des validierten HPLC-Assays zur Bestimmung der NDPK-Aktivit{\"a}t konnte gezeigt werden, dass beide Isoformen die Konversion von TGDP zu TGTP katalysieren k{\"o}nnen. Durch Quantifizierung der mRNA- und Proteinexpression von NDPK A und NDPK B sowie der Bestimmung der NDPK-Aktivit{\"a}t wurde eine systematische Analyse zur Ph{\"a}notyp- (Expression bzw. Funktion) Genotyp Korrelation dieser Enzyme in humaner Leber bzw. Blutzellen durchgef{\"u}hrt. Dabei zeigte sich eine ausgepr{\"a}gte interindividuelle Variabilit{\"a}t f{\"u}r die NDPK A- und NDPK B-Expression auf RNA und Proteinebene f{\"u}r beide Gewebetypen. Bei der Sequenzierung der relevanten Genbereiche f{\"u}r die NDPK A (NME1) wurden zahlreiche genetische Varianten identifiziert, darunter zwei bisher noch nicht beschriebene Varianten im Promotorbereich. F{\"u}r die NDPK B (NME2) konnte nur eine einzige genetische Variante detektiert werden. Mit Hilfe eines neu etablierten 16-plex MALDI-TOF MS Assays wurden genomische DNA-Proben der humanen Leberbank bzw. DNA aus Blutzellen auf diese gefundenen Varianten genotypisiert. F{\"u}r zwei Promotorvarianten von NME1 konnte ein signifikanter Einfluss auf die NDPK A-Expression gezeigt werden, diese wurden mittels electromobility shift assays (EMSA) auf Verlust der DNA-Bindungskapazit{\"a}t von Kernproteinen untersucht. Dar{\"u}ber hinaus wurde bei der Analyse verschiedener nicht genetischer Faktoren (z. B. Alter, Geschlecht, Raucherstatus, Alkoholkonsum, Medikation und Diagnose), ein signifikanter Einfluss auf die NDPK A- bzw. NDPK B Expression in humanen Leberproben von Patienten mit cholestatischen Leberparametern beobachtet. Untersuchungen zur Methylierung der NME1-Promotorbereiche mit einer hohen Dichte an CpG-Dinukleotiden, den sog. CpG-Inseln, konnten keinen signifikanten Einfluss des Methylierungsstatus auf die NME1/NDPK A-Expression zeigen. Erg{\"a}nzende Untersuchungen mit Centre d{\´E}tude du Polymorphisme Humain (CEPH)-Zelllinien best{\"a}tigten eine ausgepr{\"a}gte Variabilit{\"a}t der NDPK A- und NDPK B Expression, die durch genetische Varianten nicht erkl{\"a}rt werden konnte.},
  language  = {de}
}