TY  - THES
U1  - Dissertation / Habilitation
A1  - Hasenpusch, Daniel
T1  - Theoretische Untersuchungen zur Struktur und zum Reaktionsmechanismus der Schweineleberesterase und ihrer Isoenzyme
N2  - Es wurden theoretische Untersuchungem zu sieben verschiedenen Isoenzymen der Schweineleberesterase vorgenommen. Vorhersagen zur Struktur wurden moleküldynamisch mit Hilfe eines Kraftfeldprogramms (AMBER-Paket) durchgeführt. Der Reaktionsmechanismus wurde quantenchemisch (CPMD), sowie mit einer Hybridmethode (QM/MM) nachvollzogen. Da keine Kristallstruktur vorhanden ist, wurde auf ein Homologiemodell aus eigenen Vorarbeiten zurückgegriffen. Mit Kraftfeldberechnungen wurden die einzelnen Monomere für etwa 10 bis 14 ns simuliert. Dabei zeigte sich eine Relaxation der Enzyme nach 8 bis 10 ns. In jedem Fall wurden stabile Endstrukturen der Monomere (um die 8000 Atome plus etwa 40000 Wassermoleküle) gefunden. Am Beispiel der PLE3 wurde sogar eine partielle Entfaltung der Eingangshelix beobachtet, die in einer Rückmutation nicht wiederherstellbar war. Andererseits wurde bei der PLE1 die spontane Ausbildung einer 3-10-Helix in der Nähe der Eingangshelix gefunden. Es wurden auch stabile Endstrukturen der Trimere (um die 24000 Atome plus etwa 50000 Wassermoleküle) gefunden. Interaktionen zwischen den Monomeren wurden beobachtet, die nach 14 bis 18 ns stabil zusammenlagen. Es konnten über RMSD-Auswertungen starre und flexible Bereiche innerhalb der Isoenzyme als auch zwischen den einzelnen identifiziert werden. Die starren Bereiche stimmen sehr gut mit dem Faltungsmotiv der a/b-Hydrolasen überein. Spezifische Abstände des aktiven Zentrums wurden während der klassisch simulierten Moleküldynamiken überprüft. Dabei war es nicht möglich, mit dem in der Literatur propagierten katalytischem Glutamat Abstände in der Größenordnung einer Wasserstoff-brücke zu erhalten. Vielmehr wurde eine günstige und stabile Lage eines anderen Glutamats gefunden, wodurch sich aber nichts am allgemeinen Reaktionsmechanismus ändert. Die Zugangswege wurden durch gezwungenes Ziehen der Moleküle aus der Lösung ins aktive Zentrum beobachtet und über Kraft-Weg-Kurven ausgewertet. In Simulationen im Nanosekundenbereich konnte auch freiwilliges Eindringen der Substratmoleküle ins Enzym beobachtet werden, wobei dieser Vorgang von der Größe des Moleküls abhängt. Die bei den unterschiedlichen Simulationen gefundenen Taschen sind für jedes Substrat verschieden, obwohl die beteiligten Aminosäuren die jeweiligen Substratmoleküle fest umschließen. Dieses Anpassen der Taschen an das jeweilige Substrat passt zu dem induced-fit-Modell. Während das spontane Eindringen der Substratmoleküle innerhalb weniger Nanosekunden erfolgte, konnte erst nach einer Simulationszeit von 25 ns ein Verlassen von Methanol aus dem Enzym beobachtet werden. Mit quantenchemischen Berechnungen im Picosekundenbereich, unter Berücksichtigung der neuen Zuordnung des katalytischen Glutamats, konnte der gesamte Reaktionsmechanismus dargestellt werden. Am Beispiel des Methylbutyrats wurden die Bildung des ersten tetraedrischen Intermediats, sowie die anschließenden Abspaltungen des Alkohols und der Säure, mit Hilfe von Constraints dargestellt. Die durch die Mutationen hervorgerufenen strukturellen Veränderungen der Isoenzyme insbesondere der Eingangshelix können für die unterschiedlichen Enantioselektivitätswerte verantwortlich sein. Eine Verantwortlichkeit von Taschen für die verschiedenen Enantioselektivitäten ist aufgrund der gefundenen weichen Struktur um die Substrate mit jeweils unterschiedlich beteiligten Aminosäuren nicht erkennbar.
N2  - Theoretical investigations on seven different isoenzymes of the pig liver esterase were made. Prediction on the structure with force field methods (AMBER) were executed. The reactional mechanism was simulated with quantum chemical (CPMD) and hybrid methods (QM/MM). Because there's no crystal structure available yet, a homology model was used. Simulation time of the monomers (around 8000 atoms + around 40000 molecules of water) were 8 to 10 ns. As result stable 3D-structures were found. Unfolding of entrance helices in PLE3 and folding of 3-10 helices were obtained. Also a stable structure of a trimer of PLE1 (nearly 24000 atoms + around 50000 water molecules) was found with interactions between the monomers. With RMSD-analysis, flexible and rifid regions were found. The rigid parts are conform to the a/b-hydrolase fold schemata. Specific distances in the active site were measured, whereby a new Glu was identified as possible member of the catalytic triade. The complete reaction mechanism was reproduced on the example of the cleavage of a molecule methylbutyrate.
KW  - Molekulardynamik
KW  - Reaktionsmechanismus
KW  - Struktur
KW  - Quantenchemie
KW  - Kraftfeld-Rechnung
KW  - Schweineleberesterase
KW  - QM/MM
Y2  - 2011
U6  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001034-9
UN  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001034-9
ER  -