@phdthesis{Hintze2016,
  author    = {Stefan Hintze},
  title     = {Interaktion genereller Transkriptionsfaktoren mit dem Aktivator Ino2 der Phospholipid-Biosynthese in der Hefe Saccharomyces cerevisiae},
  journal    = {Interaction of general transcription factors with the activator Ino2 of the phospholipid biosynthesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002477-1},
  year      = {2016},
  abstract  = {In der Hefe S. cerevisiae erfolgt die Transkriptionsregulation der Strukturgene der Phospholipid-Biosynthese in Abh{\"a}ngigkeit der intrazellul{\"a}ren Konzentration der beiden Phospholipid¬vorstufen Inositol und Cholin (IC). Bei IC-Mangel kommt es zu einer Akkumulation des Signalmolek{\"u}ls Phosphatids{\"a}ure, wodurch der Repressor Opi1 extranukle{\"a}r am endoplasmatischen Retikulum (ER) verankert wird. Dadurch kann der heterodimere Aktivator Ino2/Ino4 an eine spezifische „upstream activation site” (UAS) in der Promotorregion, die als ICRE-Motiv („inositol/choline-responsive element“) bezeichnet wird, binden und die Initiation der Transkription vermitteln. Die aktivierende Wirkung geht dabei von zwei Transkriptions¬aktivierungsdom{\"a}nen (TAD) im N-Terminus von Ino2 aus. Da bisher unbekannt war, wie die Ino2-vermittelte Genaktivierung erfolgt, bestand das Ziel dieser Arbeit in der Identifizierung der Coaktivatoren, die direkt an die TADs von Ino2 binden. Ferner sollten die f{\"u}r die Transkriptionsaktivierung wichtigen Wechselwirkungen innerhalb der Coaktivatoren pr{\"a}zise kartiert werden. Es konnte hier mit Hilfe der affinit{\"a}tschromatographischen Methode des GST-„Pulldown“ gezeigt werden, dass TAD1 und TAD2 von Ino2 mit den generellen Transkriptionsfaktoren TFIID und TFIIA interagieren. Innerhalb des TFIID wurden die Untereinheiten Taf1, Taf4, Taf6, Taf10 und Taf12 in vitro als direkte Ino2-Interaktionspartner identifiziert. Dabei binden alle identifizierten Taf-Proteine an die starke TAD1, Taf10 zus{\"a}tzlich an die TAD2. Fr{\"u}here Untersuchungen hatten gezeigt, dass Mutationen innerhalb der TAD1 von Ino2 (D20K, F21R) zu einem vollst{\"a}ndigen Verlust der Aktivierungsleistung f{\"u}hren. In dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass die gerichtete Mutation dieser Aminos{\"a}uren zu einem vollst{\"a}ndigen Interaktionsverlust mit den Taf-Proteinen f{\"u}hrt. Mit Hilfe von Interaktionsexperimenten wurden innerhalb von Taf1 zwei distinkte Aktivatorinteraktionsdom{\"a}nen (AID1: AS 1-100; AID2: AS 182-250) kartiert, die die Bindung an Ino2 vermitteln. Mutationen hydrophober und basischer Aminos{\"a}ure-Reste innerhalb der Taf1-AID2 hatten einen vollst{\"a}ndigen Verlust der Interaktion mit Ino2 zur Folge. M{\"o}glicherweise sind also ionische und hydrophobe Wechselwirkungen an der Interaktion von Ino2 und Taf1 beteiligt. Mit Hilfe der Chromatin-Immunopr{\"a}zipitation (ChIP) erfolgte der Nachweis, dass Taf1 in Abh{\"a}ngigkeit von Ino2 auch in vivo an den ICRE-haltigen Promotoren INO1 und CHO2 vorhanden ist. Im Folgenden wurden auch die Ino2-Interaktionsbereiche innerhalb der Proteine Taf6, Taf10 und Taf12 durch die Generierung sukzessiver GST-Verk{\"u}rzungen eingegrenzt. Taf10 und Taf12 besitzen wie Taf1 zwei separate AIDs (Taf10: AID1 AS 1-100; AID2 AS 131-176; Taf12: AID1 AS 50-100; AID2 AS 100-178). Untersuchungen mit mutagenisierten Varianten, bei denen wie zuvor im Fall von Taf1 hydrophobe und basische Aminos{\"a}uren innerhalb der Taf12 AID2 ausgetauscht wurden, f{\"u}hrten lediglich zu einer Verringerung der Bindungsintensit{\"a}t. Dies l{\"a}sst vermuten, dass mehrere kleine Dom{\"a}nen innerhalb der AID2 existieren, die funktionell redundant sind. Mit Hilfe weiterer ChIP-Experimente konnte auch nachgewiesen werden, dass Taf6 und Taf12 abh{\"a}ngig von Ino2 an den untersuchten Promotoren INO1 und CHO2 vorhanden sind. Die Proteine Taf1 und Taf6 wurden exemplarisch f{\"u}r Genexpressionsstudien ausgew{\"a}hlt, um ihren Einfluss auf die Transkription des Gens INO1 unter in vivo Bedingungen nachzuweisen. Durch vergleichende Northernblot-Hybridisierungen mit temperatursensitiven (ts) taf-Mutanten wurde gezeigt, dass die INO1-Expression unter nichtpermissiven Bedingungen (37°C) auf 7\% (taf1ts) bzw. 4\% (taf6ts) abf{\"a}llt. Diese Befunde belegen, dass INO1 zu den Taf-abh{\"a}ngigen Genen z{\"a}hlt. Der generelle Transkriptionsfaktor TFIIA wurde ebenfalls auf eine Interaktion mit Ino2 untersucht. Bekannt war bereits, dass der Aktivator Rap1, der {\"a}hnlich wie Ino2 mit mehreren TFIID-Untereinheiten interagiert, auch TFIIA kontaktiert. Durch GST-„Pulldown“-Studien konnte die Untereinheit Toa1 als direkter Ino2-Interaktionspartner identifiziert werden. Dabei zeigte sich, dass Toa1 sowohl mit der TAD1 als auch der TAD2 von Ino2 interagiert und die TAD1 Aminos{\"a}uresubstitutionen D20K und F21R zu einem vollst{\"a}ndigen Interaktionsverlust f{\"u}hren. In dieser Arbeit konnte somit gezeigt werden, dass die generellen Transkriptionsfaktoren TFIID und TFIIA als Coaktivatoren des f{\"u}r die Transkription der Strukturgene der Phospholipid-Biosynthese essentiellen Aktivators Ino2 fungieren.},
  language  = {de}
}