@phdthesis{Balke2017, author = {Darko Balke}, title = {Entwicklung von Hairpinribozymvarianten zur ortsspezifischen RNA-Sequenzver{\"a}nderung}, journal = {Development of hairpin ribozyme variants for site-directed RNA sequence alteration}, url = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002709-1}, year = {2017}, abstract = {Das Forschungsgebiet des RNA-Engineerings besch{\"a}ftigt sich u.a. mit der Entwicklung von Ribozymen mit neuen oder verbesserten Eigenschaften. Es umfasst nicht nur den Entwurf neuer Ribozyme mittels in-vitro-Selektion oder rationalem Design, sondern auch die Validierung der entworfenen Systeme mit Hilfe von Aktivit{\"a}tstests oder strukturellen Untersuchungen. In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der Methoden des RNA-Engineerings verschiedene Hairpinribozymvarianten generiert werden, die eine ortsspezifische RNA-Sequenzver{\"a}nderung innerhalb geeigneter RNA-Substrate erlauben. Dabei war sowohl die potenzielle Anwendung dieser Ribozyme in der molekularen Medizin als auch deren Rolle als RNA-Rekombinasen in einer m{\"o}glichen RNA-Welt von Interesse. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag hierbei in der Entwicklung eines Reportersystems, welches den direkten Nachweis einer twinribozymvermittelten Reparaturreaktion in Zellen erlaubt. Das Reportersystem basiert auf der Reparatur einer Vierbasendeletion innerhalb der EGFP-mRNA. Durch rationales Design wurde ein Twinribozym generiert, das die Reparatur mit einer Reparaturproduktausbeute von 32 \% katalysiert. Das erfolgreich entwickelte Reportersystem steht somit f{\"u}r Experimente unter Zellkulturbedingungen zur Verf{\"u}gung und er{\"o}ffnet au{\"s}erdem den Weg, die Twinribozymstrategie in der Zelle zu adaptieren und zu optimieren, um sie sp{\"a}ter intrazellul{\"a}r f{\"u}r gew{\"u}nschte Ziel-RNAs anwenden zu k{\"o}nnen. Ausgehend von der den Twinribozymen eigenen Aktivit{\"a}t zur Katalyse eines RNA-Fragmentaustauschs wurde dar{\"u}ber hinaus im Kontext der RNA-Welt-Hypothese ein Hairpinribozym entwickelt, welches durch Rekombination zweier nicht-funktioneller RNA-Substrate ein funktionelles RNA-Molek{\"u}l generiert. Hierbei f{\"u}hrte die hairpinribozymvermittelte Spaltung zweier geeigneter Substrate, Rekombination der Spaltfragmente und Ligation der neuangeordneten Fragmente mit einer Rekombinationsproduktausbeute von 76\% zur Generierung eines funktionsf{\"a}higen Hammerheadribozyms.}, language = {de} }