@phdthesis{Wegelt2011,
  author    = {Anne Wegelt},
  title     = {Untersuchungen zum Strukturprotein E(rns) des Virus der Bovinen Virusdiarrhoe},
  journal    = {Analysis of the structural protein E(rns) of bovine viral diarrhea virus},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001133-9},
  year      = {2011},
  abstract  = {Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden BVDV-Mutanten mit Deletionen, Insertionen oder Substitutionen in der E(rns)-kodierenden Genomregion ausgehend von den infekti{\"o}sen cDNA-Klonen pA/BVDV und pA/BVDV/Ins- (Meyers et al., 1996) generiert. Die meisten Ver{\"a}nderungen verhinderten die Entstehung infekti{\"o}ser Virionen, so dass nichtessentielle Regionen im E(rns)-Protein nicht identifiziert werden konnten. Eine Ausnahme stellen die Aminos{\"a}uren 105-108 dar, deren Substitution im Zusammenhang mit adaptiven Mutationen toleriert wurde. Mit Hilfe von Zelllinien, die die BVDV-Strukturproteine konstitutiv exprimieren, konnte eine Mutante mit einer kompletten E(rns)-Deletion und einer internen EMCV-IRES im Genom effizient trans-komplementiert und sogenannte DISC-Viren erhalten werden. Au{\"s}erdem wurden Plasmide f{\"u}r die Expression der BVDV-Strukturproteine (C, E(rns), E1, E2) hergestellt, mit deren Hilfe erstmals ein nicht-prozessiertes E(rns)-E1-Protein mit 60-65 kDa identifiziert werden konnte, das f{\"u}r mindestens 3 h relativ stabil in transfizierten Zellen vorlag. Durch Mutation der P3-Position eines SPP-Motivs gelang es, sowohl in pCITE-2a(+)-Expressionsplasmiden als auch in BVDV-Voll{\"a}ngen-Mutanten die Spaltung dieses E(rns)-E1-Proteins zu verhindern. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die E(rns)-E1-Spaltung essentiell f{\"u}r die Bildung infekti{\"o}ser Viren ist. Bicistronische Mutanten wurden genutzt, um zu zeigen, dass das E(rns)-E1-Protein selbst jedoch nicht notwendig, aber f{\"o}rderlich f{\"u}r Entstehung infekti{\"o}ser Virionen ist. Weiterhin konnte mittels eines im Rahmen dieser Arbeit generierten polyklonalen Bungowannah Virus-E(rns)-spezifischen Kaninchenserums, das E(rns)-Protein des atypischen Pestivirus Bungowannah Virus in Western Blot-Analysen mit etwa 38 kDa detektiert werden. Da jedoch kein Bungowannah Virus-E(rns)-E1-Protein nachgewiesen werden konnte, spielt E(rns)-E1 m{\"o}glicherweise keine oder eine untergeordnete Rolle im Bungowannah Virus-Replikationszyklus. BVDV-E(rns)-Deletionen im CP7-Hintergrund konnten erfolgreich mit Bungowannah Virus-E(rns) komplementiert werden, wenn Bungowannah Virus-E(rns) und BVDV-E1 unabh{\"a}ngig von einer E(rns)-E1-Spaltung exprimiert wurden. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war es schlie{\"s}lich, eine effiziente Methode zur Konzentrierung und Reinigung infekti{\"o}ser BVDV aus infizierten Zellen zu etablieren. Zum ersten Mal wurden BVDV-Mutanten mit FLAG-markierten E(rns)- und E2-Proteinen generiert, so dass erstmalig BVDV mittels Affinit{\"a}tschromatografie gereinigt und elektronenmikroskopisch untersucht werden konnten. Mittels Negativkontrast-Elektronenmikroskopie wurden sph{\"a}rische Partikel mit Durchmessern von 43-58 nm dargestellt. Sowohl durch affinit{\"a}tschromatografische Virusreinigung als auch durch immunelektronenmikroskopische Untersuchungen konnte eine Assoziation von E(rns)- und E2-Proteinen mit der BVD-Virush{\"u}lle demonstriert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellte Methode kann als Basis f{\"u}r weiterf{\"u}hrende Untersuchungen zur Morphogenese von Pestiviren genutzt werden.},
  language  = {de}
}