@phdthesis{Grigat2016,
  author    = {Mathias Grigat},
  title     = {Wechselwirkung genspezifischer Regulatorproteine mit pleiotropen Transkriptionsfaktoren der Hefe Saccharomyces cerevisiae},
  journal    = {Interactions of specific regulatory proteins with pleiotropic transcription factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002647-6},
  year      = {2016},
  abstract  = {Die Hefe Saccharomyces cerevisiae reagiert auf die sich st{\"a}ndig {\"a}ndernden Umweltbedingungen durch eine pr{\"a}zise Regulation der Genexpression. M{\"o}glich wird dies durch ein komplexes Netzwerk aus spezifischen Regulatoren und pleiotropen Faktoren. Aktivatorproteine binden an Aktivierungssequenzen (UAS-Elemente) in ihren Zielpromotoren und rekrutieren basale Transkriptionsfaktoren sowie Coaktiva¬toren. Dadurch erh{\"o}hen sich Wahrscheinlichkeit und H{\"a}ufigkeit der Transkriptions¬initiation und die DNA im Promotorbereich wird durch die Aktivit{\"a}t von Komplexen der Chromatinremodellierung und -modifizierung f{\"u}r die Transkriptionsmaschinerie zug{\"a}nglich gemacht. Dagegen binden spezifische Repressor¬proteine an ihre Regula¬tionssequenzen (URS-Elemente) oder an Aktivatorproteine, inhibieren deren Wirkung oder rekrutieren Histondeacetylase-Komplexe wie den Sin3-Corepressor, die eine Verdichtung des Chromatins bewirken. Der Sin3-Corepressorkomplex ist an einer Vielzahl von Regulationsprozessen beteiligt. In Hefe existieren zwei Sin3-Varianten, die als Rpd3L bzw. Rpd3S bezeichnet werden und sich in ihrer Zusammensetzung unterscheiden. Neben Sin3 als zentralem Ger{\"u}st¬protein in beiden Komplexen sind im Rpd3L strukturelle Untereinheiten wie Sds3, Sap30 und Pho23 sowie die Histondeacetylase (HDAC) Rpd3 als enzymatische Komponenten enthal¬ten. Durch Funktionsanalysen von Mutanten einzelner Unterein¬heiten wurde festge¬stellt, dass zus{\"a}tzlich zu Rpd3 weitere HDACs an der Repression ICRE-abh{\"a}ngiger Gene der Phospholipid-biosynthese Gene beteiligt sind. Interaktionsstudien zeigten, dass auch die HDACs Hda1 und Hos1 an Sin3 binden. Die Bindung erfolgt {\"u}ber drei sogenannte HDAC-Interaktionsdom{\"a}nen (HID1-3), wobei Hda1 und Hos1 an HID2 und HID3 binden, Rpd3 dagegen an HID1 und HID3. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die HDACs direkt an ihre jeweiligen HIDs binden. Au{\"s}erdem inter¬agieren Hda1 und Hos1 auch in vivo mit Sin3. Die HID1 wurde auf die Aminos{\"a}uren 801-950 verk{\"u}rzt und es wurde nachge¬wiesen, dass eine funktionsf{\"a}hige katalyti¬sche Dom{\"a}ne von Rpd3 nicht f{\"u}r die Wechselwirkung mit Sin3 notwendig ist. Au{\"s}erdem wurden die Interaktionsdom{\"a}nen von Sds3 und Sin3 kartiert. Die erhaltenen Befunde erg{\"a}nzen die Daten zu Protein-Protein-Inter¬aktionen im Sin3-Corepressorkomplex und komplettieren funktionelle Aspekte der HDAC-Rekrutierung. Eine weitere Zielstellung dieser Arbeit war die Erstellung eines Interaktionsnetzwerks zwischen spezifischen Aktivatoren und allgemeinen Faktoren der Transkription. Eukaryotische Aktivatorproteine sind modular aufgebaut und besitzen voneinander separierbare Funktionsdom{\"a}nen. Die Erkennung und Bindung von UAS-Elementen in den Zielpromotoren erfolgt {\"u}ber die DNA-Bindedom{\"a}ne (DBD), w{\"a}hrend Tran¬skriptions¬¬aktivierungs¬dom{\"a}nen (TADs) basale Transkriptionsfaktoren und Co¬aktiva¬toren rekrutieren und somit die aktivierende Wirkung vermitteln. Im Gegensatz zu den DBDs folgen TADs meist keinen durch Sequenzanalysen vorhersagbaren Strukturmotiven und m{\"u}ssen manuell eingegrenzt werden. F{\"u}r die Kartierung funktioneller TADs wurden L{\"a}ngenvarianten von {\"u}ber 30 Aktiva-toren aus verschiedenen Familien DNA-bindender Proteine an die Gal4DBD fusioniert und auf ihre F{\"a}higkeit {\"u}berpr{\"u}ft, ein UASGAL-abh{\"a}ngiges Reportergen zu aktivieren. Dabei konnten 15 neue TADs eingegrenzt werden. Weiterhin wurden die bisher nicht charakterisierten Zinkcluster¬proteine Yjl206c, Yer184c, Yll054c und Ylr278c als Aktivatoren best{\"a}tigt. Dadurch stand eine Samm¬lung aus 20 bekannten und neukartierten TADs zur Verf{\"u}gung, die nach Konstruktion von GST-Fusionen f{\"u}r in vitro-Interaktionsexperimente mit Unter¬einheiten des Mediators, des TFIID- und des SWI/SNF-Komplexes eingesetzt wurden. Es konnten direkte Wechselwirkungen von Aktivatoren (u. a. Aft2, Aro80, Mac1 und Zap1) mit den TFIID-Komponenten TBP, Taf1, Taf4 und Taf5 detektiert werden. Die Bindung an Taf1 erfolgte im Bereich von aa 1-250, der zwei Aktivator¬interaktions-dom{\"a}nen (AID) enth{\"a}lt und in vorangegangenen Experimenten auch mit Ino2 und Adr1 interagierte. Die Rap1-Bindedom{\"a}ne (RBD) von Taf4 (aa 253-344) interagierte auch mit Mac1, Aft2 und Ino2. Daher wurde dieser Bereich als allgemeine AID klassifiziert. F{\"u}r die Aktivatorinteraktion essentielle Aminos{\"a}uren konnten allerdings nicht identi¬fiziert werden. 17 von 20 TADs interagierten direkt mit der Mediator-Untereinheit Med15, w{\"a}hrend f{\"u}r Med17 10 Kontakte zu Aktivatoren detektiert wurden, was die Relevanz des Mediators f{\"u}r die Aktivatorfunktion unterstreicht. Die katalytische Untereinheit des SWI/SNF-Komplexes Swi2 zeigte {\"a}hnlich viele TAD-Interaktionen wie Med15. Der N-terminale Bereich von Swi2 (aa 1-450) stellte sich als ausreichend f{\"u}r die Bindung der Aktivatoren heraus und enth{\"a}lt demnach eine oder mehrere AIDs. Damit konnte das Interaktionsnetzwerk zwischen Aktivatoren und allgemeinen transkriptionalen Cofaktoren substantiell erweitert werden.},
  language  = {de}
}