@phdthesis{Schaletzki2017,
  author    = {Yvonne Schaletzki},
  title     = {Proteininteraktionen von thrombozyt{\"a}ren Transportproteinen},
  journal    = {Protein interaction of platelets transport proteins},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002756-0},
  year      = {2017},
  abstract  = {Das MRP4 ist ein Mitglied der ABCC-Subfamilie der ATP-binding cassette transporters. Es transportiert eine gro{\"s}e Vielfalt an endogenen und xenobiotischen Verbindungen aus der Zelle. Des Weiteren vermittelt MRP4 den Transport von Signalmolek{\"u}len wie z.B. zyklische Nukleotide. Das einzigartige Substratspektrum, die Regulation und die zellul{\"a}re Lokalisation des MRP4 stehen in Verbindung mit seiner m{\"o}glichen Funktion beim Zell-Schutz und dem zellul{\"a}ren Signaling. MRP4 ist abh{\"a}ngig vom Zelltyp entweder in der basolateralen (Prostata, Leber) oder apikalen (Nieren, Kapillaren des Gehirns) Membran von polarisierten Zellen lokalisiert. Des Weiteren wird MRP4 auch in Thrombozyten und Erythrozyten exprimiert. Protein-Protein-Interaktionen k{\"o}nnen die Funktion, Lokalisation und Expression von Transportern in der Plasmamembran beeinflussen. Viele Interaktionen beinhalten die stabile Assoziation von Proteinen innerhalb von Multi-Untereinheitskomplexen sowie die vor{\"u}bergehende Assoziation von regulatorischen Proteinen. MRP4 weist u.a. ein sogenanntes PDZ-Bindemotiv auf, welches durch die Aminos{\"a}uren ETAL charakterisiert wird und die Interaktion mit PDZ-Adaptorproteinen vermitteln kann. Speziell in Thrombozyten ist MRP4 neben der Plasmamembran auch in den δ-Granula lokalisiert. Hier k{\"o}nnten interagierende Proteine eine wichtige Rolle spielen. {\"A}nderungen in diesen Proteinen k{\"o}nnten eine Ursache f{\"u}r St{\"o}rungen der Thrombozytenfunktion mit einer Fehllokalisation von MRP4 sein. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung m{\"o}glicher Interaktionspartner von MRP4, insbesondere in Thrombozyten. Daf{\"u}r wurde ein Fusionsprotein aus einem c-terminalen Fragment (117 Aminos{\"a}uren) des MRP4 mit der Glutathion-S-Transferase (GST) generiert. Nach Aufreinigung des Fusionsproteins (GST-MRP4) mittels Glutathion-Sepharose wurden pull-down-Experimente mit Thrombozytenlysat durchgef{\"u}hrt. Mittels Western Blot und LC-MS/MS-Analyse konnten als m{\"o}gliche Interaktionspartner das EBP50/NHERF1, das PSD95, SNX27, die β-Untereinheit des AP3B1 und das HSP90 identifiziert werden. Durch indirekte Immunfluoreszenz konnte au{\"s}erdem eine partielle Ko-Lokalisation der genannten m{\"o}glichen Interaktionspartner und MRP4 in den Thrombozyten dargestellt werden. Ein weiterer Ansatz zur Untersuchung der Protein-Interaktion war die Ko-Pr{\"a}zipitation des MRP4 und der daran gebundenen Proteine mittels eines anti-MRP4-Antik{\"o}rpers, der an magnetische beads gebunden war. Mithilfe der Ko-Immunpr{\"a}zipitation konnten SNX27, HSP90, AP3B1, EBP50 und PSD95 unterschiedlich stark ko-pr{\"a}zipitiert werden. Es wurde untersucht, inwiefern das PDZ-Bindemotiv des MRP4 f{\"u}r die Interaktion der detektierten Interaktionsproteine essentiell ist. Daf{\"u}r wurde ein GST-MRP4-Konstrukt ohne das C-terminale PDZ-Motiv generiert. Damit konnte gezeigt werden, dass das PDZ-Bindemotiv nur f{\"u}r die Interaktion mit SNX27, EBP50 und PSD95 notwendig ist, w{\"a}hrend die Bindung von AP3B1 und HSP90 unabh{\"a}ngig davon erfolgte. Nachdem auf Proteinebene mit verschiedenen Versuchen dargestellt werden konnte, welche Adaptorproteine mit dem MRP4 interagieren, sollte im letzten Abschnitt auf funktioneller Ebene gezeigt werden, inwiefern sich die Lokalisation des MRP4 ver{\"a}ndert, sofern das Bindemotiv des MRP4 nicht mehr vorhanden ist bzw. die Adaptorproteine herunterreguliert werden. In Bezug auf das Herunterregulieren der Adaptorproteine wurde die megakaryoblastische Leuk{\"a}mie-Zelllinie M07e als Modell f{\"u}r Thrombozyten-Vorl{\"a}uferzellen verwendet. Des Weiteren lag das Interesse bei den Interaktionsproteinen AP3, PSD95 und SNX27. Nach Transfektion der M07e-Zellen mit der entsprechenden siRNA und der sich anschlie{\"s}enden Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, dass die Ko-Lokalisation des MRP4 mit den Adaptorproteinen nach knock-down verringert und die Plasmamembran-Lokalisation von MRP4 signifikant gesteigert war. Umgekehrt sollte die {\"U}berexpression dieser Adaptorproteine die Plasmamembran-Lokalisation verringern. Dies wurde exemplarisch f{\"u}r SNX27 in MDCK-Zellen untersucht. Dabei sollte auch nochmals die Rolle des PDZ-Bindungsmotivs f{\"u}r die MRP4-Lokalisation gezeigt werden. Daf{\"u}r wurden die Fluoreszenz-markierten Fusionsproteine CFP-MRP4, SNX27-YFP und das CFP-MRP4(-PDZ) synthetisiert, in MDCK-Zellen transfiziert und ihre Lokalisation mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Es zeigte sich, dass nach Ko-Transfektion des CFP-MRP4 mit SNX27-YFP das MRP4 haupts{\"a}chlich im Zell-Inneren lokalisiert war. Au{\"s}erdem wurde verdeutlicht, dass das PDZ-Bindemotiv f{\"u}r die Internalisierung des MRP4 in das Innere der Zelle durch das Interaktionsprotein SNX27 essentiell ist. Zusammenfassend liefert diese Arbeit wichtige grundlegende Erkenntnisse zu m{\"o}glichen Protein-Interaktionen von MRP4 und deren Einfluss auf die Lokalisation des Transporters. Deren m{\"o}gliche physiologische und pathophysiologische Rolle f{\"u}r die MRP4-Funktion in Thrombozyten sollte in weiterf{\"u}hrenden Studien n{\"a}her untersucht werden.},
  language  = {de}
}