TY - THES U1 - Dissertation / Habilitation A1 - Oetter, Kay-Marcus T1 - Strukturelle Determinanten des pestiviralen Glykoproteins E(RNS) für die Retention, Sekretion und proteolytische Prozessierung N2 - Das Genus Pestivirus gehört zur Familie der Flaviviridae und enthält eine Reihe von tierpathogenen Erregern, welche (fast) ausschließlich Paarhufer befallen. Das bei Pestiviren vorkommende Strukturprotein ERNS ist einzigartig in der Familie Flaviviridae, es finden sich keine homologen Proteine in den anderen Genera dieser Familie. ERNS ist ein sehr ungewöhnliches Protein, da es für ein virales Strukturprotein verschiedene untypische Eigenschaften aufweist. Neben einer intrinsischen RNase-Aktivität findet sich am C Terminus eine sehr ungewöhnliche Signalpeptidase-Spaltstelle. Während die RNase Aktivität einen wichtigen Virulenzfaktor darstellt, sorgt die ungewöhnliche Spaltstelle mutmaßlich für die verlangsamte Prozessierung des ERNS-E1-Vorläuferproteins. Inwieweit die verlangsamte Spaltung des Vorläuferproteins für das Virus wichtig sein könnte, ist bis dato noch ungeklärt. Auch ist die Ausbildung von Dimeren wichtig für die Virulenz von ERNS. Darüber hinaus erfolgt eine partielle Sekretion von ERNS in den extrazellulären Raum, während ein Großteil in der Zelle verbleibt. Zusätzlich verfügt ERNS über eine untypische Membranverankerung, die durch eine lange, C-terminale amphipathische Helix vermittelt wird. Innerhalb dieser amphipathischen Helix findet sich eine Reihe geladener Aminosäuren, deren Lokalisation und Anordnung zu zwei spiegelsymmetrisch komplementären Gruppen bei Pestiviren konserviert ist. Es stellte sich die Frage, welche biologische Relevanz dieses Muster an geladenen Aminosäuren haben könnte. Ausgehend von der vorgeschlagenen Ausbildung eines „Charge Zippers“ – durch Rückfaltung und Ausbildung von Salzbrücken zwischen den komplementären Ladungen –, wurden mittels transienten Expressionsexperimenten die sechs hoch konservierten Ladungen im „Inneren“ des möglichen „Reißverschlusses“ untersucht, und es zeigte sich, dass der postulierte Charge-Zipper-Mechanismus bei ERNS vermutlich keine Rolle spielt. Für einige der betrachteten Aminosäuren konnten Hinweise erhalten werden, dass sie eine Rolle bei der Prozessierung, der Retention und bei der Dimerisierung von ERNS spielen. Vor allem ein Austausch der Ladung an der Position 194 im ERNS zeigte einen signifikanten Einfluss auf die Prozessierung und Retention von ERNS. Auch bei der Dimerisierung stach diese Position hervor, da entgegen anderer Mutationen ein Austausch hier zu einer vermehrten Dimerbildung führte. Weiterführend wurden diese Mutationen in rekombinante Viren eingeführt, und es zeigte sich, dass vor allem die spezifischen Ladungen an den Positionen 184 und 191 im ERNS wichtig für die effiziente Virusvermehrung sind. Ladungsaustausche an diesen Positionen sorgten für nicht lebensfähige Virusmutanten, während Alaninsubstitutionen im Lauf von Passagen zur ursprünglichen Ladung revertierten. Diese Ergebnisse zeigen die elementare Bedeutung der Ladungen für die Generierung von infektiösen Viren. Die molekularen Mechanismen, in denen diese Reste von Bedeutung sind, müssen in weiteren Arbeiten noch aufgeklärt werden. N2 - The genus Pestivirus belongs to the family Flaviviridae and contains several pathogens which (almost) exclusively infect cloven-hoofed animals. The pestiviral structural protein ERNS is unique within the Flaviviridae with no homologous protein being found in the other genera of this family. ERNS is a quite uncommon viral structural protein with various atypical properties. In addition to an intrinsic RNase activity, a very unusual signal peptidase cleavage site can be found at the C-terminal end of ERNS. While the RNase activity is an important virulence factor of pestiviruses, it is assumed that the unusual signal peptidase cleavage site might be involved in the slow processing of the ERNS-E1 precursor protein. To what extent the slow cleavage of the precursor protein might be important for the virus has still not been clarified. Furthermore, the formation of dimers is also important for the virulence of ERNS. In addition, ERNS is partially secreted into the extracellular space, while the majority remains inside the cell. It is worth remarking that ERNS possesses a very uncommon membrane anchoring mediated by a long, C-terminal amphipathic helix. Within this amphipathic helix a series of charged amino acids can be found. Their location and arrangement of two mirror-symmetric complementary groups is highly conserved among pestiviruses. The question arose whether this pattern of charged amino acids might be of any biological relevance. Based on the proposed formation of a "charge zipper" – by refolding and formation of salt bridges between the complementary charges – transient expression experiments were performed with a focus on the six “innermost” highly conserved charges of the assumed charge zipper. The respective results suggest that the postulated charge zipper mechanism might probably not be applicable to ERNS. For some of the amino acids examined, evidence was obtained that they might play a part in the processing, retention and dimerization of ERNS. Particularly a charge exchange at position 194 in ERNS showed a significant influence on the processing and retention of the protein. Regarding an influence on the dimerization of ERNS, position 194 stood out again. Contrary to other mutations, a charge exchange at this position lead to an increase in dimer formation. In addition, mutations were introduced in recombinant viruses, and it was shown that the particular charges at position 184 and 191 in ERNS are important for efficient virus proliferation. Charge exchanges at these positions lead to non-viable virus mutants, while alanine substitutions reverted back to the original charge over several virus passages. These results show the elemental relevance of these charges for the generation of infectious viruses. The molecular mechanisms for which these residues are of particular importance have to be solved in further studies. KW - Pestivirus KW - Flaviviren KW - Flaviviridae KW - RNS-Viren KW - ERNS KW - E(RNS) KW - E0 KW - gp44/48 Y2 - 2017 U6 - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002863-6 UN - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002863-6 ER -