@phdthesis{Berthold2016, author = {Tom Berthold}, title = {Molekulare und funktionelle Charakterisierung der Aktivierung von Granulozyten durch Antik{\"o}rper gegen das Humane Neutrophilen-Antigen-3a}, journal = {Molecular and functional characterization of the activation of neutrophils by antibodies directed against the human neutrophil alloantigen-3a}, url = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002657-1}, year = {2016}, abstract = {Die Transfusionsassoziierte Akute Lungeninsuffizienz (TRALI) ist die h{\"a}ufigste t{\"o}dliche Nebenwirkung der Transfusion von Blutprodukten und wird oft durch mittransfundierte leukozytenreaktive Antik{\"o}rper (AK) induziert. AK gegen das Humane Neutrophilenantigen (HNA)-3a verursachen h{\"a}ufig schwere F{\"a}lle der TRALI. HNA-3a ist auf dem Gro{\"s}teil der Blutzelltypen exprimiert und entsteht durch einen Einzelnukleotidpolymorphismus im Gen des „choline transporter-like protein 2“ (CTL2), welcher zur Substitution der Aminos{\"a}ureposition 154 in der Sequenz des Proteins f{\"u}hrt. Klinische Beobachtungen und zahlreiche Studien legen nahe, dass TRALI-induzierende AK die Akkumulation und Aktivierung von Granulozyten im Lungenkapillarbett verursachen. Durch den Zusammenbruch der Kapillarbarriere kommt es in der Folge zu einem Lungen{\"o}dem. Die Entwicklung eines Hochdurchsatzverfahrens zur Detektion von HNA-3a-AK in Blutprodukten und die Identifizierung therapierelevanter Schaltstellen, im Pathomechanismus der HNA-3a-AK-induzierten TRALI, waren daher Hauptschwerpunkte dieser Studie. In diesem Zusammenhang wurde ein Nachweissystem f{\"u}r HNA-3a-AK auf der Grundlage von CTL2-Fragmenten etabliert. Ein Screening zahlreicher Anti-HNA-3a-Plasmen ergab, dass mit CTL2-Peptiden in Festphasentests jedoch nur etwa 50\% aller HNA-3a-AK nachgewiesen werden k{\"o}nnen. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Detektion aller HNA-3a-AK nur mit zellbasierten Methoden m{\"o}glich ist, bei denen CTL2 in seiner nat{\"u}rlichen Konformation vorliegt. Diese Studie leistet damit einen wichtigen Beitrag zur Charakterisierung des konformationssensitiven Epitops der HNA-3a-AK und identifiziert wichtige Grundvoraussetzungen f{\"u}r Methoden zum Nachweis dieser AK. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung der Interaktion zwischen HNA-3a-AK und Granulozyten. Dieser experimentelle Ansatz gr{\"u}ndet auf histopathologischen Lungenuntersuchungen verstorbener TRALI-Patienten, die eine massive Akkumulation und Aggregation von Granulozyten in den Kapillaren aufzeigen. Aus diesem Grund erfolgte die Untersuchung dieser Interaktion zun{\"a}chst hinsichtlich verschiedener Parameter, die zu einer gesteigerten Sequestrierung von Granulozyten in der Lunge f{\"u}hren k{\"o}nnen. Hierzu geh{\"o}ren die Granulozytenaggregation (GA), die Versteifung von Zellen und die Zelladh{\"a}sion. Die Modifikation des Standard-Granulozytenaggregationstests ergab, dass die HNA-2- und HNA-3a-AK-induzierte GA aktive Prozesse sind, welche unabh{\"a}ngig von Plasmafaktoren stattfinden, jedoch von der Aktivit{\"a}t einer bislang noch nicht identifizierten Serinprotease abh{\"a}ngig sind. Hierbei wurden potente Aggregationsinhibitoren identifiziert welche auch als potenzielle Therapeutika zur Behandlung von TRALI in Frage kommen. Mit Hilfe desselben Testsystems konnte ermittelt werden, dass voraktivierte Granulozyten eine erh{\"o}hte Aggregationsneigung aufweisen. Im Zusammenhang mit dem Schwellenwertmodell der TRALI liefert dieses Ergebnis eine m{\"o}gliche Erkl{\"a}rung, warum Patienten mit schweren Vorerkrankungen h{\"a}ufiger an TRALI erkranken. Neben der GA wurden in dieser Studie zwei weitere Eigenschaften identifiziert, die eine Akkumulation der Zellen in den engen Lungenkapillaren erkl{\"a}ren: deren Elastizit{\"a}t und Adh{\"a}sivit{\"a}t. Mithilfe der Rasterkraftmikroskopie wurde nachgewiesen, dass HNA-3a-AK eine Versteifung von Granulozyten induzieren. Ebenso wurde gezeigt, dass HNA-3a-AK das Integrin Mac-1 (CD11b/CD18) auf der Granulozytenoberfl{\"a}che aktivieren, was zu einer verst{\"a}rkten Adh{\"a}sion der Zellen an Fibrinogen f{\"u}hrt. Steifere und adh{\"a}sivere Granulozyten akkumulieren m{\"o}glicherweise vermehrt in den Lungenkapillaren. Eine weitere wichtige Fragestellung dieser Studie war, ob HNA-3a-AK eine direkte Aktivierung von Granulozyten ausl{\"o}sen. Die Untersuchungen ergaben, dass die Aktivierung von CD11b, weder mit der Erh{\"o}hung der CD11b-Expression, bzw. mit der proteolytischen Abspaltung von L-Selektin, noch mit einer Sauerstoffradikalproduktion einhergeht. Dieses ungew{\"o}hnliche Muster an Ver{\"a}nderungen deutet nicht auf eine Aktivierung zytotoxischer Antworten hin. Seit kurzem ist bekannt, dass HNA-3a-AK Kapillarendothelzellen auch auf direktem Wege aktivieren und dass selbst in Granulozyten-depletierten M{\"a}usen schwache TRALI-Symptome auftreten. Demzufolge ergibt sich ein neues Modell der HNA-3a-AK-induzierten TRALI: Nach Transfusion von HNA-3a-AK bleiben aggregierte, steifere und adh{\"a}sivere Granulozyten in den engen Lungenkapillaren stecken und interagieren dort mit dem aktivierten Gef{\"a}{\"s}endothel. Durch diese Interaktion kommt es vermutlich zur Aktivierung der Granulozyten und zu einer starken Inflammationsreaktion, welche eine weitere Zerst{\"o}rung der Lungenkapillaren und schlie{\"s}lich ein schweres Lungen{\"o}dem zur Folge hat. Die besondere Schwere der HNA-3a-AK-induzierter TRALI entsteht also vermutlich nicht aufgrund einer direkten und starken Granulozytenaktivierung, sondern vielmehr durch die gleichzeitige Beeinflussung verschiedener epitoptragender Zelltypen.}, language = {de} }