@phdthesis{Rublack2014,
  author    = {Nico Rublack},
  title     = {Synthese von Nukleosidanaloga zur Funktionalisierung und Strukturaufkl{\"a}rung von RNA},
  journal    = {Synthesis of nucleoside analogues for functionalization and elucidation of RNA structures},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002118-7},
  year      = {2014},
  abstract  = {Es wurden vier Nukleosid-Analoga hergestellt, deren Anwendungsbereiche g{\"a}nzlich unterschiedlicher Natur sind. Sie stellen wichtige Hilfsmittel zur Erweiterung der Eigenschaften und zur Charakterisierung von Nukleins{\"a}uren dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Voraussetzungen f{\"u}r die Selektion eines Cytidindesaminase-Ribozyms geschaffen. Es wurde ein Assay f{\"u}r die in-vitro-Selektion vorgestellt und das zu diesem Zweck notwendige Schl{\"u}sselmolek{\"u}l, ein Cytidin-Derivat, designt und mit einer Gesamtausbeute von 8 \% synthetisiert. Das Nukleosid wurde in einer 16-stufigen Synthese mit zwei unterschiedlichen Linkereinheiten funktionalisiert und stellt ein effektives Werkzeug zur Selektion von Cytidindesaminase-Ribozymen dar. Das bifunktionalisierte Cytidin-Substrat wurde {\"u}ber seine 5’-OH Gruppe mit einem Hexaethylenglykol-Linker versehen, der eine prim{\"a}re Aminogruppe aufwies. {\"U}ber eine kurze Linkereinheit an der C4-Position der Nukleobase wurde ein Biotinrest angef{\"u}gt. Die angestrebte Selektionsstrategie sieht die Oxidation des 3’-Endes einer RNA-Bibliothek mittels Natriumperiodat vor. Das resultierende Dialdehyd soll anschlie{\"s}end mit der prim{\"a}ren Aminogruppe des Cytidin-Derivats umgesetzt werden. Ein Protokoll zur Anbindung des synthetisierten Cytidins an eine an ihrem 3’-Terminus oxidierte RNA wurde entwickelt und steht f{\"u}r die zuk{\"u}nftige Selektion zur Verf{\"u}gung. Der Nachweis des Konjugats aus RNA und dem Cytidin-Derivat erfolgte mittels HPLC, sowie massenspektrometrisch. Die RNA-Bibliothek zur Selektion eines Cytidindesaminase-Ribozyms wurde ausgehend von zwei Klenow-Primern hergestellt und steht ebenfalls bereit. Parallel zu den Arbeiten der Synthese des Cytidins, wurden im Rahmen zweier Kooperationen drei weitere Nukleosid-Analoga dargestellt. Das erste Kooperationsprojekt sah die Herstellung einer kurzen RNA vor. Es handelte sich dabei um die hochmodifizierte Anticodonschleife der tRNA(Lys) aus E. coli. Zur chemischen Festphasensynthese dieser 17mer RNA waren die Phosphoramiditbausteine von N6-Threonylcarbamoyladenosin (t6A) und 2-Thiouridin (s2U) erforderlich. Die Synthesen der Nukleosid-Analoga t6A und s2U, sowie deren Umwandlungen in die jeweiligen Phosphoramidite wurden vorgestellt. Die Darstellung von s2U erfolgte nach Protokollen von Vorbr{\"u}ggen und Strehlke mit einer Gesamtausbeute von 78 \%.W{\"a}hrend des Schutzes der 2’-OH Gruppe mit TBDMS, bildete sich haupts{\"a}chlich das 3’-O-TBDMS-Isomer, das sich nur sehr schwer vom 2’-O-TBDMS-Isomer separieren lie{\"s}. Durch Verwendung der Schutzgruppe Di-tert-butylsilandiylditriflat zur Synthese des s2U-Phosphoramidits konnte das Problem der Bildung des 3’-O-TBDMS-Isomers behoben werden. Die erste Synthese eines t6A-Derivats orientierte sich an Vorschriften von Davis et al. und lieferte das Produkt mit einer Gesamtausbeute von 25 \% {\"u}ber 7 Schritte. Dar{\"u}ber hinaus wurde eine zweite Synthesestrategie entworfen, die auf der Verwendung eines Isocyanats von L-Threonin basierte. Die Aminos{\"a}ure Threonin wurde mit zwei verschiedenen Silylschutzgruppen versehen, die beide kompatibel mit der Phosphoramiditchemie w{\"a}hrend der chemischen RNA-Synthese waren. Das Isocyanat wurde mit guten Ausbeuten dargestellt und anschlie{\"s}end sowohl mit ungesch{\"u}tztem, als auch mit gesch{\"u}tztem Adenosin zur Reaktion gebracht. In beiden F{\"a}llen wurde ein t6A-Derivat erhalten. Die Umsetzung mit einem gesch{\"u}tzten Adenosin lieferte das t6A-Derivat mit einer Gesamtausbeute von 20\% {\"u}ber 8 Stufen. Es wurde somit eine – in Bezug auf Ausbeute und Arbeitsaufwand – gleichwertige Alternativsynthese zur Darstellung von t6A-Derivaten entwickelt. Aus den beiden modifizierten Nukleosiden s2U und t6A wurden die Phosphoramidit-Bausteine generiert. Durch den erfolgreichen Einbau beider Nukleoside in eine 17mer RNA konnte die Anticodon-Schleife der tRNALys hergestellt werden. Die Bearbeitung des zweiten Kooperationsthemas erforderte die Herstellung eines isotopenmarkierten Pseudouridins. Es wurde eine vergleichende Synthese von 15N- markiertem Pseudouridin durch Adaption zweier unterschiedlicher Protokolle durchgef{\"u}hrt. Die erste Strategie, eine 7-stufige Synthese, lieferte die Zielverbindung mit einer Ausbeute von 2\% {\"u}ber alle Schritte ausgehend von D-Ribose. Bezogen auf den 15N-Harnstoff betrug die Gesamtausbeute 14 \%. Grund f{\"u}r die geringe Gesamtausbeute war eine unvermeidliche Isomerisierung der beta-Form der D-Ribose zum nicht reagierenden alpha-Anomer w{\"a}hrend der Lacton-Bildung, sowie der geringe Umsatz w{\"a}hrend der Reaktion mit dem 15N-angereicherten Harnstoff. Die zweite Strategie gab das 15N-markierte Pseudouridin mit einer Gesamtausbeute von 9 \% {\"u}ber 9 Schritte. F{\"u}r die Synthese von Uracil wurde eine alternative Vorschrift verwendet, bei der Propins{\"a}ure mit Harnstoff umgesetzt wurde. Dar{\"u}ber hinaus wurde festgestellt, dass auf karzinogene L{\"o}sungsmittel, sowie anderer Reagenzien ohne Ausbeuteverluste verzichtet werden konnte.},
  language  = {de}
}