@phdthesis{Schulz2014,
  author    = {Katharina Stephanie Schulz},
  title     = {Untersuchung des pUL31- und pUL34-unabh{\"a}ngigen Kernaustritts des Pseudorabies Virus},
  journal    = {Analysis of Pseudorabies Virus pUL31- and pUL34- independent nuclear egress},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001794-5},
  year      = {2014},
  abstract  = {Der Kernaustritt der Nukleokapside stellt einen essentiellen Schritt im Replikationszyklus der Herpesviren dar. Aufgrund seiner Gr{\"o}{\"s}e kann das Kapsid den Kern nicht durch die Kernporen verlassen, sondern wird durch die Kernmembranen transportiert. Die viralen Proteine pUL34 und pUL31 bilden den NEC (nuclear egress complex), der virale und zellul{\"a}re Kinasen an die Kernmembran rekrutiert. Diese phosphorylieren die Lamine, wodurch sich die Lamina partiell aufl{\"o}st und das Nukleokapsid Zugang zur Kernmembran erh{\"a}lt. Die Deletion einer oder beider Komponenten des NEC bewirkt zwar eine deutliche Reduktion der viralen Titer, jedoch wird eine geringe Menge infekti{\"o}ser Nachkommenviren freigesetzt, die f{\"u}r eine Reversionsanalyse genutzt wurde. Daf{\"u}r wurde zuerst das UL34-negative Virus und sp{\"a}ter auch das UL31-negative Virus, auf Kaninchennierenzellen (RK13) seriell passagiert, bis im {\"U}berstand Wildtyp-{\"a}hnliche Titer erreicht wurden. Aus diesen {\"U}berst{\"a}nden wurden Virusmutanten isoliert, die ohne den NEC effizient replizierten und als PrV-ΔUL34Pass bzw. PrV-ΔUL31Pass bezeichnet wurden. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass die passagierten Viren nicht mehr wie der PrV-Wildtyp durch die Kernmembran transportiert, sondern durch eine partiell aufgel{\"o}ste Kernmembran ins Zytoplasma freigesetzt wurden. Das Ziel dieser Arbeit war zu untersuchen, wie die Freisetzung der Kapside aus dem Kern ohne den essentiellen NEC abl{\"a}uft. Um zu ermitteln, welche viralen Proteine f{\"u}r die Aufl{\"o}sung der Kernmembran von Bedeutung sein k{\"o}nnten, wurde zun{\"a}chst das komplette Genom von PrV-ΔUL34Pass sequenziert und mit dem des Wildtyps (PrV-Ka) und der nicht passagierten UL34-Deletionsmutante (PrV-ΔUL34) verglichen. Die mutierten Gene wurden anschlie{\"s}end in PrV-ΔUL31Pass sequenziert. Zu den sieben Genen, die in beiden passagierten Viren ver{\"a}ndert sind, geh{\"o}ren u.a. UL21, UL26, UL46 und UL49. Jedoch konnte durch Deletion der einzelnen mutierten Gene nicht gekl{\"a}rt werden, welches Genprodukt f{\"u}r die Kernmembran-Fragmentierung in PrV-ΔUL34Pass- oder PrV-ΔUL31Pass infizierten Zellen bzw. f{\"u}r die Stabilisierung der Kernmembran w{\"a}hrend der Wildtyp-Infektion verantwortlich ist. Mit Hilfe von Inhibitorstudien wurde untersucht, welche zellul{\"a}ren Prozesse von den passagierten Viren manipuliert werden k{\"o}nnten, um die Kernmembran-Fragmentierung zu induzieren. Der Cdk (Cyclin dependent kinase) 1, Cdk2 und Cdk5-Inhibitor Roscovitin, der in h{\"o}heren Dosen auch ERK1/2 (extracellular regulated kinase 1/2) hemmt, reduzierte die Titer der passagierten Viren deutlich, w{\"a}hrend der PrV-Wildtyp kaum beeinflusst wurde. Einen {\"a}hnlichen Effekt konnte auch mit einem Inhibitor f{\"u}r die ERK1/2 vorgeschaltete Kinase MEK1/2 (mitogen activated protein kinase/ERK kinase 1/2) erzielt werden. Spezifische Inhibitoren von ERK1/2, Cdk1, Cdk2 oder Cdk5 zeigten jedoch keinen spezifischen Einfluss auf die passagierten Virusmutanten oder den Wildtyp. Zur selben Zeit konnte eine andere Arbeitsgruppe zeigen, dass das Varizella Zoster Virus pUL46 Homolog ORF12 die Aktivierung von ERK1/2 induziert (Liu et al., J. Virol. 86, 2012). Basierend auf dieser Studie wurde untersucht, ob PrV pUL46 ebenfalls ERK1/2 aktivieren kann und ob diese Aktivierung f{\"u}r die Aufl{\"o}sung der Kernmembran von Bedeutung ist. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl PrV-Wildtyp als auch PrV-ΔUL34Pass pUL46 ERK1/2 und die entsprechenden Zielgene aktivierte. Die Deletion von UL46 aus dem Genom der passagierten Viren resultierte au{\"s}erdem in einem deutlich h{\"o}heren Anteil von Zellen mit einer fragmentierten Kernmembran, wobei dies nicht ausschlie{\"s}lich auf die Aktivierung von ERK1/2 durch pUL46 zur{\"u}ckgef{\"u}hrt werden kann, da sich die beiden passagierten Viren in ihrem ERK-Aktivierungspotential unterscheiden. W{\"a}hrend PrV-ΔUL31Pass ERK1/2 vergleichbar zum Wildtyp induzierte, war die Aktivierung durch PrV-ΔUL34Pass deutlich geringer. Diese Abweichung l{\"a}sst sich nicht auf die unterschiedlichen pUL46-Proteine der beiden passagierten Virusmutanten zur{\"u}ckf{\"u}hren, da der Austausch der jeweiligen UL46 Sequenzen gegen Wildtyp UL46 das ERK1/2-Aktivierungsmuster nicht ver{\"a}nderte. Somit scheint pUL46 einen Einfluss auf die Stabilit{\"a}t der Kernmembran und die Aktivierung von ERK zu haben. Beide passierte Viren bilden verst{\"a}rkt Synzytien im Vergleich zum PrV-Wildtyp oder den nicht-passagierten Vorl{\"a}ufern aus. Um zu untersuchen, ob diese Deregulierung der Membranfusion auch die Kernmembranen betrifft und m{\"o}glicherweise eine Ursache f{\"u}r die Fragmentierung sein k{\"o}nnte, wurden die Glykoproteine gB und gH aus den Genomen der passagierten Virusmutanten deletiert. Elektronenmikroskopische Aufnahmen sowie Untersuchungen von Replikationsverhalten und Plaquebildung ergaben, dass die Fragmentierung der Kernmembran auch in Abwesenheit von gB oder gH stattfindet. Dagegen sind beide Glykoproteine, wie auch im PrV-Wildtyp, f{\"u}r die Virusreplikation essentiell.},
  language  = {de}
}