@phdthesis{Petkovic2014,
  author    = {Sonja Petkovic},
  title     = {RNA Funktionskontrolle durch strukturelles Design},
  journal    = {Control of RNA function by structural design},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002093-5},
  year      = {2014},
  abstract  = {Das Hairpin-Ribozym-basierte System CRZ-2 wurde verwendet, um Selbst-Prozessierungsprodukte nach Ribozym-Reaktion zu untersuchen. Inter- und intramolekulare Ribozym-Reaktionen sollten mit CRZ-2 und dem entsprechenden linearen 83mer (l-83mer) durchgef{\"u}hrt und Oligomere und zyklisierte RNAs nachgewiesen werden. {\"U}ber die Bildung der intermedi{\"a}ren Spaltprodukte und des finalen Spaltproduktes konnte der Ablauf der Spalt-Kaskade komplett gezeigt werden. Dies war insbesondere durch vergleichende Verwendung von Test-Systemen im denaturierenden Polyacrylamid-Gel m{\"o}glich, da eines der Systeme eine eindeutige Separation der Produkte im Gel zul{\"a}sst. Weiter konnten die zwei erwarteten Spalt-Produkte (83mer und 92mer) {\"u}ber Sequenzierung ihrer komplement{\"a}ren DNAs nachgewiesen werden. Um zwischen zyklischen und linearen Reaktionsprodukten unterscheiden zu k{\"o}nnen, wurden folgende Methoden herangezogen: i) 2D-PAGE ii) exonukleolytischer Abbau von RNA in L{\"o}sung und im Gel, iii) Vergleich des Laufverhaltens eines inaktiven RNA-Monomers mit dem Reaktionsgemisch des l-83mer nach Ligationsreaktion, iv) AFM und v) Ferguson-Plot. Es zeigte sich, dass das CRZ-2 nach Ribozym-Reaktion ausschlie{\"s}lich lineare Produkte und Oligomere bis zum Trimer hervorbringt, w{\"a}hrend das l-83mer nach Ligationsreaktion auch einen Ring, das zyklische 83mer, hervorbringt. Das Wissen um die Art der Reaktionsprodukte von CRZ-2 und dem l-83mer erm{\"o}glichten es, diese beiden RNAs als Referenz-Systeme zu benutzen, um Hairpin-Ribozym-basierte Varianten zu untersuchen. Die bioinformatische Entwicklung neuer Varianten erfolgte in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Ivo Hofacker (Universit{\"a}t Wien). Dabei wurde ein wahrscheinlichkeitsbasierter Entwurf (probability based design, kurz: PBD) f{\"u}r RNA-Sekund{\"a}rstrukturen mittels Programm Switch.pl aus dem Vienna RNA package 2.0 verwendet. Die f{\"u}r die katalytische Aktivit{\"a}t der Hairpin-Ribozym-Varianten essentiellen Basenfolgen in den Loops wurden beibehalten. Alle Test-Systeme waren bistabil, denn sie zeigten indirekt, das die f{\"u}r CRZ-2 {\"u}bliche Spalt-Kaskade durchlaufen wurde, indem das jeweilige zyklische 83mer {\"u}ber 2D-PAGE nachgewiesen wurde. Wie erwartet, waren die Varianten insgesamt aktiver als das Referenzsystem CRZ-2 und sie unterschieden sich, wie bioinformatisch charakterisiert, in ihrem Zirkularisationsverhalten bez{\"u}glich der Monomere. Bioinformatisch unerwartet war das Zyklisierungsverhalten der Dimere. Ausschlie{\"s}lich bei Test-System 4 k{\"o}nnten gem{\"a}{\"s} 2D-PAGE und AFM Analyse unter anderem auch dimere RNA-Ring entstanden sein. PBD4 ist das System, bei welchem die geringste Dimer-Zyklisierungstendenz angenommen wurde. Eine erste Evaluierung der PBD-Methode ergibt somit, dass die Erwartungen f{\"u}r die bioinformatische Charakterisierung des Ablaufs der Spalt-Kaskade bis zur Monomerzyklisierung erf{\"u}llt wurden. F{\"u}r die bioinformatisch nicht vorausgesagten experimentellen Ergebnisse, z.B. bei der Dimerzyklisierung, k{\"o}nnten verst{\"a}rkt terti{\"a}re Interaktionen relevant sein, die mit der PBD-Methode zur Sekund{\"a}rstrukturvorhersage nicht ber{\"u}cksichtigt werden. Sequenz-Alignments der Test-Systeme zu CRZ-2 lie{\"s}en R{\"u}ckschl{\"u}sse auf die Funktionen einzelner Basen zu. Vier Basen traten zus{\"a}tzlich zu den vorgegebenen Sequenzen auf. Diese befinden sich in einer Helix und k{\"o}nnten kritisch f{\"u}r das Zustandekommen dieser Helix als wichtiges Strukturelement im bistabilen Ribozym sein. Dieser Aspekt k{\"o}nnte in weiterf{\"u}hrenden Arbeiten mit rationalem Design z.B. {\"u}ber Einfach- oder Doppelmutation weiter untersucht und die Auswirkungen auf die Selbst-Prozessierungsereignisse analysiert werden. Interessant sind auch die eingef{\"u}hrten Mutationen im superstabilen Tetraloop der Hairpin-Ribozym-Varianten. Im Sequenz-Alignment zeigte sich, dass sich PBD3 und 4 nur um zwei sich im Tetraloop befindlichen Basen unterscheiden (Positionen 1 und 3). Da sich die beiden Systeme bez{\"u}glich ihrer Oligomerisierungs- und Zyklisierungstendenz unterscheiden, sind diese beiden Positionen f{\"u}r die Funktionen essentiell.},
  language  = {de}
}