@phdthesis{Marschall2013,
  author    = {Thomas Marschall},
  title     = {Evolution und Charakterisierung von Aptameren gegen Pl{\"a}ttchenfaktor 4},
  journal    = {Evolution and Characterization of Aptamers targeting Platelet Factor 4},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001527-9},
  year      = {2013},
  abstract  = {Im Rahmen dieser Arbeit sollten Aptamere selektiert und charakterisiert werden, die an PF4 binden. PF4 ist ein kleines Cytokin, das aufgrund seiner Beteiligung an der Heparin induzierten Thrombozytopenie von gesteigertem klinischen Interesse ist und dessen biologische Funktion noch weitgehend unklar ist. Aptamere k{\"o}nnen aufgrund ihres breiten Anwendungsspektrums einen Beitrag leisten unbekannte Funktionen von Proteinen aufzukl{\"a}ren bzw. pathogene Effekte von Proteinen zu verhindern.Zu diesem Zweck wurden zwei unterschiedliche Selektionen durchgef{\"u}hrt. In einer ersten Selektion wurden die Bedingungen so angepasst, dass vor allem Sequenzen im Pool verblieben, die besonders gro{\"s}e Komplexe mit PF4 bilden. Solch gro{\"s}e Komplexe aus PF4 und Heparin stellen das Hauptantigen der HIT dar und durch strukturelle Untersuchungen k{\"o}nnten Vorhersagen getroffen werden, welche therapeutisch eingesetzten Aptamere potentiell immunogen wirken k{\"o}nnten. Nach Analyse der Sekund{\"a}rstrukturen der erhaltenen Sequenzen durch Faltungsprogramme konnten neben st{\"a}bchenf{\"o}rmigen Sekund{\"a}rstrukturen vor allem three- und four-way junctions als dominierende Sekund{\"a}rstrukturmerkmale identifiziert werden. Auf Grundlage dieser Resultate wurde ein Modell entwickelt, wonach die Ausbildung gro{\"s}er Komplexe zwischen RNA und PF4 durch das Vorhandensein mehrerer Helices in einem Molek{\"u}l RNA gef{\"o}rdert wird und dadurch gro{\"s}e Netzwerke aus RNA und PF4 entstehen. Um einen Anhaltspunkt zu erhalten, welches der selektierten Aptamere eine erh{\"o}hte Neigung zur Komplexbildung aufweist, wurden die Bindungseigenschaften zun{\"a}chst qualitativ im Gelshift-Assay bei erh{\"o}hten NaCl-Konzentrationen untersucht. Dabei kristallisierten sich f{\"u}nf Aptamere heraus, die auch bei NaCl-Konzentrationen h{\"o}her als die der finalen Selektionsrunde noch zur Bindung f{\"a}hig waren.Diese Sequenzen wurden mittels Photonenkorrelationsspektroskopie untersucht um Aussagen zur Komplexgr{\"o}{\"s}e und Stabilit{\"a}t zu erhalten. Basierend auf den Ergebnissen der PCS erfolgte die Synthese zweier Derivate der vielversprechendsten Sequenz. F{\"u}r alle drei Konstrukte konnte die Komplexbildung im Gelshift Assay nachgewiesen werden. In einer zweiten Selektion wurden die Bedingungen so gew{\"a}hlt, dass an deren Ende spezifisch bindende Aptamere erhalten wurden. Zun{\"a}chst erfolgte ein Vergleich der Bindungseigenschaften der in dieser Selektion erhaltenen Aptamere mit denen der vorangegangenen Selektion. Dabei konnten deutlich Unterschiede mittels Gelshift-Analyse nachgewiesen werden. Zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten wurde versucht einen eigenen Sensorchip aufzubauen unter Verwendung vonPolyethylenglykol. Auch dies f{\"u}hrte nicht zum gew{\"u}nschten Erfolg und f{\"u}hrte dazu, dass versucht wurde die Dissoziationskonstanten durch Immobilisierung von PF4 zu bestimmen. Durch die Struktur von PF4, in der die Monomere nichtkovalent miteinander verbunden sind, gelang es wiederum nicht eine stabile Oberfl{\"a}che zu generieren, wodurch sich die Verwendung des Biacors zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten als ungeeignet herausstellte. Aus diesem Grund wurde versucht die Dissoziationskonstanten durch CD-Spektroskopie zu ermitteln. Nach Auswertung der Spektren konnte festgestellt werden, dass durch die Bindung der RNA an PF4 eine Struktur{\"a}nderung im Protein induziert wird, durch die der Anteil antiparalleler β-Faltbl{\"a}tter zunimmt und der Anteil α-helikaler Bereiche und β-Turns abnimmt. Gleichzeitig wurde deutlich, dass sowohl spezifische- als auch elektrostatische Interaktionen einen Beitrag zur Bindung der Aptamere an PF4 leisten, wobei bei hohen Konzentrationen der Beitrag der elektrostatischen Wechselwirkungen {\"u}berwiegt. Durch diese Kombination aus spezifischen und elektrostatischen Wechselwirkungen ist eine genaue Bestimmung der Dissoziationskonstanten nicht m{\"o}glich und f{\"u}r die Aptamere konnte nur ein erster Anhaltspunkt, bestimmt werden.},
  language  = {de}
}