@phdthesis{Lange2019,
  author    = {Carsten Lange},
  title     = {Vergleich der Zelltodmechanismen nach Temoporfin-basierter Photodynamischer Therapie und Kombination mit Platin(II)-Komplexen oder Glutathionperoxidase-Inhibitoren in humanen Krebszelllinien},
  journal    = {Comparison of cellular death pathways after temoporfin-mediated photodynamic therapy and combination with Pt(II) complexes or glutathione peroxidase inhibitors in human cancer cell lines},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-33974},
  pages     = {228},
  year      = {2019},
  abstract  = {Das Porphyrin-Derivat 5,10,15,20-tetra(m-Hydroxyphenyl)chlorin (mTHPC, Temoporfin), in Europa zugelassen unter dem Handelsnamen Foscan®, stellt einen der vielversprechendsten Photosensibilisatoren (PS) in der Photodynamischen Therapie (PDT) dar. W{\"a}hrend einige Publikationen {\"u}ber die Aktivit{\"a}t von Temoporfin in einzelnen Krebszelllinien in der Fachliteratur erschienen sind, fehlen systematische Studien {\"u}ber die Temoporfin-basierte PDT, die mithilfe eines Sets aus mehreren Krebszelllinien durchgef{\"u}hrt wurden. In der vorliegenden Dissertation wurden f{\"u}nf humane, adh{\"a}rente Krebszelllinien aus dem Kopf-Hals-Bereich und weiteren PDT-relevanten Geweben eingesetzt, um die Ausl{\"o}sung von oxidativem Stress und die zugrundeliegenden Zelltodmechanismen der Temoporfin-basierten PDT in vitro zu untersuchen. Daf{\"u}r wurde zun{\"a}chst die Viabilit{\"a}t der Zellen nach Temoporfin-Behandlung (0,001–5,0 µmol/L) und Bestrahlung mit einer LED-basierter Apparatur (0,2–5,5 J/cm2) im MTT-Test ermittelt und Konzentrations-Wirkungskurven zur Bestimmung von IC50- und IC90-Werten aufgenommen. Zur Untersuchung und zum Vergleich der Zelltodmechanismen in den Zelllinien wurden diese anschlie{\"s}end mit {\"a}quitoxischen Konzentrationen des Temoporfins behandelt und mit vorrangig mit einer Lichtdosis von 1,8 J/cm2 (vereinzelt auch 3,5 oder 7,0 J/cm2) bestrahlt. Die Analytik der Zellen erfolgte direkt, 6, 24, oder 48 h nach der Bestrahlung. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation best{\"a}tigen die Ausl{\"o}sung von oxidativem Stress nach der Temoporfin-PDT durch die Detektion eines Totalverlustes des mitochondrialen Membranpotentials (Δψm) sowie einer erh{\"o}hten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Eine Lipidperoxidation (LPO) sowie die Beteiligung einer Nekrose am Zelltod spielen hingegen in den meisten Zelllinien eine untergeordnete Rolle. Vor allem die ausbleibende Nekrose nach einer hochdosierten PDT mit Temoporfin steht dabei in Kontrast zu den Resultaten vieler publizierter Studien. Als vorherrschender Zelltodmechanismus wurde nach Temoporfin-vermittelter PDT stattdessen {\"u}ber eine Phosphatidylserin-Externalisierung, eine Caspase 3-Aktivierung und eine PARP-Spaltung eine Ausl{\"o}sung von Apoptose identifiziert. Zudem kann parallel zur Apoptose eine Autophagie ausgel{\"o}st werden bzw. kann diese zun{\"a}chst sogar dominieren, bevor sie zu einer Autophagie-assoziierten Apoptose f{\"u}hrt. Als Anzeichen der sp{\"a}ten Phase einer Apoptose ist zudem fr{\"u}her oder sp{\"a}ter eine DNA-Fragmentierung nachweisbar, und der Zelltod wird in einigen F{\"a}llen von einem Zellzyklusarrest in der G2/M-Phase begleitet. Neben der Auswertung der Zelltodmechanismen wurde ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Dissertation auf den Vergleich der Ergebnisse aus verschiedenen, identisch behandelten Zelllinien gelegt. Obwohl die Zellen unter {\"a}quitoxischen Bedingungen behandelt wurden und die PDT {\"u}ber eine vergleichsweise unspezifische Bildung von ROS wirkt, wurden sehr heterogene Resultate in den unterschiedlichen Zelllinien erhalten. Die vorliegende Untersuchung zeigt deshalb au{\"s}erdem, dass generelle Schlussfolgerungen nach einer PDT eine Analytik in mehreren unterschiedlichen Zelllinien ben{\"o}tigt, um verl{\"a}sslich zu sein. Dieser Umstand ist in der Vergangenheit in In-vitro-Studien zur PDT jedoch viel zu h{\"a}ufig ignoriert worden. Die Pt(II)-Komplexe Carboplatin (CBDCA), Cisplatin (CDDP) und Oxaliplatin (1-OHP) werden als Zytostatika in einer Vielzahl chemotherapeutischer Verfahren eingesetzt. In der vorliegenden Dissertation wurden die Pt(II)-Komplexe CBDCA, CDDP, oder 1-OHP in f{\"u}nf humanen, adh{\"a}renten Krebszelllinien mit einer Temoporfin-basierten PDT kombiniert. Die Zellviabilit{\"a}t wurde im MTT-Test bestimmt und synergistische Effekte der Kombination mithilfe der Berechnung von Combination Indices (CI) ermittelt. Synergismus wurde dabei nach einigen Kombinationen, z.B. mit 1-OHP in drei der f{\"u}nf getesteten Zelllinien, beobachtet, aber auch antagonistische Effekte wurden f{\"u}r einige Kombinationen in bestimmten Zelllinien detektiert. Im Fall einer Synergie wurden erh{\"o}hte ROS-Level nachgewiesen, jedoch wurde die Ausl{\"o}sung von Apoptose im Vergleich zu einer Behandlung mit den Pt(II)-Komplexen bzw. der PDT allein dadurch nicht notwendigerweise verst{\"a}rkt. Eine Analyse der Zellzyklusverteilung ergab, dass nach kombinierter Behandlung sub-G1-Populationen mit fragmentierter DNA, die f{\"u}r eine sp{\"a}te Phase der Apoptose charakteristisch sind, gebildet werden, und zudem S-Phase und G2/M-Arreste vorliegen. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zeigen, dass eine Behandlung mit einer Temoporfin-basierten PDT das Potential besitzt, einige Typen von Tumorzellen gegen{\"u}ber Pt(II)-Komplexen, vor allem 1-OHP, zu sensibilisieren und so besser f{\"u}r die Tumortherapie zug{\"a}nglich zu machen. Das Erreichen synergistischer Effekte h{\"a}ngt dabei jedoch in hohem Ma{\"s}e vom Ursprungsgewebe und tumorspezifischen Eigenschaften der Zellen ab und es k{\"o}nnen sogar antagonistische Effekte auftreten. Die Glutathionperoxidase 1 (GPX1) kann bei einer {\"U}berexpression in Tumorzellen zu einer Inhibition von Apoptose f{\"u}hren, was zum {\"U}berleben der Tumorzellen beitr{\"a}gt. Zudem kann eine erh{\"o}hte GPX-Aktivit{\"a}t zu einer Resistenzentwicklung gegen{\"u}ber oxidativen Sch{\"a}den beitragen, was den Tumor z.B. vor Chemotherapeutika sch{\"u}tzen kann. Potential in der Tumortherapie besitzen deshalb GPX-Inhibitoren, die einer {\"U}berexpression der GPX1 durch Verringerung der Gesamtaktivit{\"a}t entgegen¬wirken. In Kombination mit Chemotherapeutika f{\"u}hrten GPX-Inhibitoren so bereits zu einer Re-Sensibilisierung Zytostatika-resistenter Zelllinien. In der vorliegenden Dissertation wurde eine Kombination der GPX-Inhibitoren 9-Chlor-6-ethyl-6H-[1,2,3,4,5]pentathiepino[6,7-b]indol (CEPI), ein k{\"u}rzlich synthetisiertes trizyklisches Pentathiepin, oder Mercaptobernsteins{\"a}ure (MBS), der klassische Inhibitor der GPX in vielen ver{\"o}ffentlichten Studien, mit einer Temoporfin-PDT eingesetzt, um durch die Blockierung eines effektiven Abbauweges f{\"u}r H2O2 eine vermehrte Akkumulation von ROS zu erzeugen und so den phototoxischen Effekt des Temoporfins zu verst{\"a}rken. Synergismus wurde dabei nach Kombination mit beiden GPX-Inhibitoren, jedoch nicht in allen f{\"u}nf Zelllinien, beobachtet. Auf der anderen Seite wurden mit beiden Inhibitoren auch antagonistische Effekte in bestimmten Zelllinien detektiert. Die ROS-Level konnten nach kombinierter Behandlung mit CEPI, nicht jedoch mit MBS, in einigen Zelllinien gesteigert werden, was darauf hindeutet, dass die Inhibition der GPX durch CEPI tats{\"a}chlich zu einer zus{\"a}tzlichen Akkumulation von ROS f{\"u}hrt. Beide Inhibitoren erzeugen allein keine Steigerung der ROS-Spiegel. {\"U}berraschenderweise wurde eine vermehrte Apoptoseausl{\"o}sung anschlie{\"s}end jedoch nach Kombination mit beiden GPX-Inhibitoren in allen untersuchten Zelllinien erreicht, was darauf schlie{\"s}en l{\"a}sst, dass weitere Faktoren die Induktion von Apoptose f{\"o}rdern, z.B. eine Autophagie-assoziierter Zelltodmechanismus oder eine Ferroptose, die durch LPO nach Verlust der GPX4-Aktivit{\"a}t eingeleitet wird. Die erh{\"o}hte Apoptoseausl{\"o}sung wurde zudem in der Zellzyklusanalyse best{\"a}tigt, in der nach kombinierter Behandlung mit beiden GPX1-Inhibitoren erh{\"o}hte Anteile apoptotischer sub-G1-Frak¬tionen mit fragmentierter DNA nachweisbar waren. Zudem wurde die DNA-Fragmentierung nach Kombination mit MBS von einem gesteigerten G2/M-Arrest begleitet. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zeigen, dass eine Kombination von Inhibitoren der GPX mit einer Temoporfin-basierten PDT zu synergistischen Effekten f{\"u}hren kann, wodurch eine Verst{\"a}rkung der Phototoxizit{\"a}t m{\"o}glich ist. Da die Inhibitoren in nicht-toxischen Konzentrationen eingesetzt werden, werden zudem keine zus{\"a}tzlichen Nebenwirkungen erwartet. Der Erfolg des kombinierten Ansatzes h{\"a}ngt dabei jedoch in hohem Ma{\"s}e vom Ursprungsgewebe und tumorspezifischen Eigenschaften der Zellen ab, aber auch antagonistische Effekte k{\"o}nnen auftreten.},
  language  = {de}
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