@phdthesis{Brack2014,
  author    = {Christiane Brack},
  title     = {Charakterisierung von bakteriolytischen Bakterien aus Brackwasser unter besonderer Ber{\"u}cksichtigung von Bacillus-Arten},
  journal    = {Characterization of bacteriolytic bacteria from brackish water with special regard to Bacillus species},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001999-6},
  year      = {2014},
  abstract  = {Die Synthese und der Abbau von mikrobieller Biomasse sind fundamentale biologische Prozesse auf unserer Erde. Im Gegensatz zu zellul{\"a}ren Syntheseleistungen wurde der Eliminierung von mikrobieller Biomasse allerdings bisher weniger Aufmerksamkeit geschenkt. Die Aufl{\"o}sung von Bakterienzellen wird als Bakteriolyse bezeichnet. Innerhalb von nat{\"u}rlichen Bakteriengemeinschaften wird die Bakteriolyse eingeleitet durch verschiedene mikrobielle Prozesse und wird schlie{\"s}lich durch die Degradation komplexer bakterieller Zellwandbausteine bedingt. Sie ist ein fundamentaler Vorgang zur Energie- und N{\"a}hrstoffversorgung, sowohl im Rahmen der Saprotrophie, also dem Abbau von toten Bakterienzellen, als auch der Bakterivorie, der Pr{\"a}dation an lebenden Bakterien. Der Prozess der Bakteriolyse ist bei beiden Ern{\"a}hrungstypen abh{\"a}ngig von extrazellul{\"a}ren Enzymen und bioaktiven Metaboliten, die den enzymatischen Angriff erm{\"o}glichen oder verst{\"a}rken und letztlich zur Zerst{\"o}rung des Zellmaterials beitragen. Bakteriolytische Substanzen und Metaboliten besitzen eine hohe Anwendungsrelevanz, beispielsweise f{\"u}r die Zur{\"u}ckdr{\"a}ngung von Bakterien in vielen verschiedenen Bereichen des Lebens und werden in Anbetracht der weltweit steigenden Verbreitung von Krankheits- und Schaderregern sowie von Antibiotikaresistenzen dringend ben{\"o}tigt. Um Zugang zu neuen antimikrobiellen Substanzklassen zu erhalten, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit 35 stark bakteriolytische Bakterienisolate aus Brackwasser gewonnen und charakterisiert, darunter 31 von verschiedenen Probenahmeorten der Ostsee und 4 aus dem brackwasserhaltigen Bereich des Balchaschsees in Kasachstan. Alle bakteriolytischen Isolate wurden morphologisch und physiologisch charakterisiert. Eine Auswahl bakteriolytischer St{\"a}mme wurde zus{\"a}tzlich taxonomisch identifiziert. Von den bakteriolytischen Umweltisolaten aus der Ostsee konnten zehn St{\"a}mme eindeutig den vier Bacillus-Arten B. pumilus, B. subtilis, B. megaterium und B. licheniformis zugeordnet werden (Brack et al. 2013). Unter den Isolaten aus dem Balchaschsee wurden drei St{\"a}mme als Pseudomonas veronii und ein Stamm als Paenibacillus apiarius identifiziert. Die Isolate aus dem Balchaschsee zeichneten sich durch eine starke Lyseaktivit{\"a}t gegen{\"u}ber lebenden Zellen von Pseudomonas putida, Escherichia coli, Micrococcus luteus und Arthrobacter citreus aus und waren zum Teil in der Lage, auch autoklavierte Zellen dieser Arten zu degradieren. F{\"u}r das Isolat Paenibacillus apiarius SBUG 1947 wurde nach Analyse von Wachstumskurven und elektronenmikroskopischen Aufnahmen eine besonders deutliche Lyseaktivit{\"a}t gegen{\"u}ber lebenden Zellen von A. citreus in Fl{\"u}ssigkultur nachgewiesen (Brack et al. 2014c). In einem umfangreichen systematischen Screening {\"u}ber die bakteriellen Isolate aus der Ostsee zeigten ausgew{\"a}hlte Bacillus-St{\"a}mme aller vier identifizierten Arten lytische Aktivit{\"a}ten gegen{\"u}ber lebenden Zellen von grampositiven und gramnegativen Bakterien der Arten Arthrobacter citreus, Micrococcus luteus und Pseudomonas putida sowie zum Teil gegen{\"u}ber Hefen wie Trichosporon mucoides. Diese und weitere Mikroorganismen wie Aeromonas sp., Bacillus subtilis, Chromobacterium violaceum, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa und Serratia marcescens wurden in Form von autoklavierten und pasteurisierten Zellen ebenfalls durch die Bacillus-St{\"a}mme lysiert (Brack et al. 2013). Das stark bakteriolytische Isolat B. pumilus SBUG 1800 zeigte zudem in Fl{\"u}ssigkultur eine deutliche Bakteriolyseaktivit{\"a}t gegen pasteurisierte und lebende Zellen von A. citreus, wobei selbst ein geringes Inokulum von B. pumilus zu einer raschen Abt{\"o}tung sowie Aufl{\"o}sung der Wirtszellen f{\"u}hrte, wie in Wachstumsversuchen und mit Hilfe von elektronenmikroskopischen Aufnahmen gezeigt werden konnte. Die st{\"a}rkste Lyseaktivit{\"a}t gegen{\"u}ber lebensf{\"a}higen A. citreus-Zellen konnte nach 3,5 bis 4,5 Stunden der Inkubation in Co-Kultur mit verd{\"u}nnter N{\"a}hrbouillon beobachtet werden. Um den Bakteriolyseprozess genauer zu charakterisieren, wurden im Folgenden Ver{\"a}nderungen im extrazellul{\"a}ren Metabolom und Proteom unter verschiedenen Kulturbedingungen untersucht. So wiesen die zellfreien Kultur{\"u}berst{\"a}nde von B. pumilus SBUG 1800, coinkubiert mit pasteurisierten Zellen von A. citreus, nachweislich eine starke bakteriolytische Aktivit{\"a}t auf, was auf die Anwesenheit von extrazellul{\"a}ren Lysefaktoren hindeutete. Diese lytischen Faktoren sollten mit Hilfe von analytischen Messmethoden nachgewiesen und biochemisch charakterisiert werden. Mittels gekoppelter Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und Fl{\"u}ssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) wurden im Kultur{\"u}berstand von B. pumilus SBUG 1800, inkubiert in Gegenwart von pasteurisierten Zellen von A. citreus, verschiedene 2,5 Diketopiperazine detektiert. Hierdurch gelang der erste wissenschaftliche Nachweis der Sekretion der Diketopiperazine Cyclo(-Ala-Pro), Cyclo(-Gly-Pro), Cyclo(-Val-Pro), Cyclo( Ile-Pro), Cyclo(-Leu-Pro), Cyclo(-Pro-Pro), Cyclo (-HyP-Pro), Cyclo (-Pro-Met) und Cyclo(-Phe-Pro) durch das Umweltisolat B. pumilus SBUG 1800 aus der Ostsee sowie auch durch den Laborstamm B. pumilus SBUG 1921 (auch B. pumilus Jo2). Beide St{\"a}mme reagierten nach 4 h der Inkubation in einem Mineralsalzmedium mit einer erh{\"o}hten Produktion der Diketopiperazine Cyclo(-Gly-Pro), Cyclo(-Ala-Pro) und Cyclo(-Val-Pro) auf das Vorhandensein pasteurisierter A. citreus-Zellen. Auch in zehnfach verd{\"u}nnter N{\"a}hrbouillon wurden diese Diketopiperazine produziert. Die detektierten antimikrobiellen Diketopiperazine wiesen gegen{\"u}ber verschiedenen Testst{\"a}mmen eine Hemmwirkung auf, die bereits bei sehr geringen Konzentrationen von 1 µg ml-1 einsetzte. F{\"u}r die Diketopiperazine konnte jedoch keine bakteriolytische Funktion nachgewiesen werden, weder gegen{\"u}ber lebenden noch gegen{\"u}ber abget{\"o}teten Bakterienzellen (Brack et al. 2014a). Sie wirken daher als Stoffwechsel inaktivierende Vorstufe f{\"u}r einen nachfolgend einsetzenden bakteriolytischen Prozess. Um den unbekannten Lysefaktor aus dem zellfreien {\"U}berstand von B. pumilus SBUG 1800 zu identifizieren, wurde unter anderem die Lipopeptid-Fraktion der Zellen gewonnen und mittels LC-MS analysiert. Dabei wurden neun verschiedene Pumilacidine, darunter zwei bislang unbeschriebene Lipopeptide mit den Molek{\"u}lmassen 1007 und 1021, detektiert. Da die Lipopeptidextrakte lebende Wirtzellen lysierten, k{\"o}nnen die Pumilacidine als eine erste Gruppe von wirksamen Lysefaktoren im untersuchten Pr{\"a}dator-Wirt-System angesehen werden. Die Konzentration der Pumilacidine ist {\"a}hnlich der Diketopiperazin-Konzentration nach vier Stunden der Inkubation in verd{\"u}nnter N{\"a}hrbouillon h{\"o}her in Anwesenheit von pasteurisierten oder lebenden Zellen von A. citreus als im Kontrollmedium ohne Wirtszellen. Neben den antimikrobiellen Diketopiperazinen und den bakteriolytischen Pumilacidinen konnte mittels Gelelektrophorese die bakteriolytische Wirksamkeit einer gro{\"s}en Bandbreite von extrazellul{\"a}ren Enzymen aus B. pumilus SBUG 1800 nachgewiesen werden. Zwei der bakteriolytisch wirksamen Enzyme konnten mit Hilfe massenspektrometrischer Methoden als die Zellwandhydrolasen N-Acetylmuramoyl-L-Alaninamidase und β N Acetylglukosaminidase identifiziert werden (Brack et al. 2014b). Im Kontext der aktuellen Fachliteratur deuten die hier vorgestellten Ergebnisse darauf hin, dass Bacillus-Arten sich als Intragilden-Pr{\"a}datoren in das marine mikrobielle Nahrungsnetz einordnen lassen. Bei Nahrungsmangel, vergleichbar mit dem Wachstum in der vielfach verwendeten, zehnfach verd{\"u}nnten N{\"a}hrbouillon, greift B. pumilus benachbarte Mikroorganismen an, um diese als N{\"a}hrstoff- und Energiequellen f{\"u}r das eigene {\"U}berleben zu nutzen durch die damit verbundene Lyse von Nahrungskonkurrenten den Prozess der eigenen Sporulation zu retardieren. Der Vorgang der Bakteriolyse im untersuchten Pr{\"a}dator-Wirt-System l{\"a}uft dabei nach dem dargelegten Kenntnisstand folgenderma{\"s}en ab. In der Co-Kultur wird das Wachstum der Wirtsbakterienart A. citreus durch neun verschiedene Diketopiperazine mit antibakterieller Wirksamkeit inhibiert. Die Gesamtkonzentration der Diketopiperazine liegt bei {\"u}ber 80 µg ml-1. Gleichzeitig verursachen die ausgeschiedenen Pumilacidine A bis I als Hauptfaktoren der Bakteriolyse die initiale Zellpermeabilisierung, und den Zelltod der Wirtsbakterien, wahrscheinlich bedingt durch eine Desintegration von Membranstrukturen, woraufhin der austretende Zellinhalt im Medium verf{\"u}gbar wird. F{\"u}r die Degradation der freiwerdenden makromolekularen N{\"a}hrstoffe sekretiert B. pumilus ein breites Spektrum von verschiedenen hydrolytischen extrazellul{\"a}ren Enzymen, welche die komplexen Zellbestandteile zu metabolisierbaren Oligomeren und Monomeren zersetzen (Brack et al. 2014b). Auf der Grundlage der neuen Erkenntnisse {\"u}ber den Hergang der Bakteriolyse im ausgew{\"a}hlten Pr{\"a}dator-Wirt-System k{\"o}nnen neue, anwendungsrelevante Ans{\"a}tze f{\"u}r die Zur{\"u}ckdr{\"a}ngung von sch{\"a}dlichen Mikroorganismen abgeleitet werden. Neben der detailliert untersuchten Art Bacillus pumilus stehen weitere lytische Bakterien zur Verf{\"u}gung, deren Wirkstoffe und lytische Enzyme, ein gro{\"s}es Potential zur Zerst{\"o}rung von mikrobiellen Zellen und},
  language  = {de}
}