@phdthesis{Krause2013, author = {Kristin Krause}, title = {Enzymatische Charakterisierung des Intermedi{\"a}r- und Fermentationsstoffwechsels von Staphylococcus aureus COL und Bacillus subtilis 168}, journal = {Enzymatic characterisation of the intermediary and fermentative metabolism of Staphylococcus aureus COL and Bacillus subtilis 168}, url = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001407-6}, year = {2013}, abstract = {Staphylococcus aureus (S. aureus) ist einer der meist gef{\"u}rchtetsten pathogenen Mikroorganismen, der verantwortlich ist f{\"u}r eine Vielzahl von nosokomialen Infektionen und Krankheiten. S. aureus ist in der Lage, sich an ver{\"a}ndernde Umweltbedingungen auf Ebene der Genexpression anzupassen, was zu unterschiedlichen Proteinzusammensetzungen und somit zu Ver{\"a}nderungen in der Metabolitenkomposition und metabolischen Aktivit{\"a}t f{\"u}hrt. Au{\"s}erdem stellt die F{\"a}higkeit, Resistenzen gegen gegenw{\"a}rtig genutzte Antibiotika zu entwickeln, eine Gefahr dar und macht diesen Keim in seiner Behandlung so schwierig. F{\"u}r ein vollst{\"a}ndiges Verstehen der Proteom-, Transkriptom- und Metabolomdaten ist die Untersuchung der Enzymaktivit{\"a}ten ein entscheidendes Hilfsmittel. In der vorliegenden Arbeit wurden die enzymkatalytischen Eigenschaften sowie die spezifischen Enzymaktivit{\"a}ten der Enzyme des Intermedi{\"a}r- und Fermentationsstoffwechsels untersucht. Aus Zellen der logarithmischen, transienten und station{\"a}ren Wachstumsphase unter aeroben wie auch anaeroben Bedingungen wurden f{\"u}r die Enzyme das pH-Optimum, die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (vmax) und die Substratkonzentration der halbmaximalen Reaktionsgeschwindigkeit (Km) bestimmt. In S. aureus COL wird die Glucose unter aeroben Bedingungen haupts{\"a}chlich {\"u}ber die Glycolyse metabolisiert. Glucose-6-phosphat wird weiter zu Pyruvat umgesetzt, welches wiederum durch die Pyruvat-Oxidase zu Acetylphosphat oder durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex zu Acetyl-CoA verstoffwechselt wird. Durch die Phosphatacetyl-Transferase wird das Acetyl-CoA im Folgenden ebenfalls zu Acetylphosphat umgesetzt und nicht dem Citrat-Zyklus zugef{\"u}hrt. Die Acetat-Kinase nutzt das Acetylphosphat zur Generierung von ATP. Geringe extrazellul{\"a}re Lactat-Konzentrationen weisen auf eine geringere Bedeutung der Lactat-Dehydrogenase unter aeroben Wachstumsbedingungen hin. Gleichwohl wird ein kleiner Teil des Pyruvates zur Regeneration von NAD+ durch die Lactat-Dehydrogenase genutzt. In der transienten und station{\"a}ren Wachstumsphase werden die Gene der Enzyme f{\"u}r Gluconeogenese und Citrat-Zyklus vermehrt exprimiert. Lactat und Acetat werden als Kohlenstoff- und Energiequelle wieder aufgenommen und dienen der Bildung unterschiedlicher Intermediate, wie beispielsweise der Bildung von NADPH {\"u}ber Glucose-6-phosphat im Pentose-Phosphat-Weg. Lediglich die Citrat-Synthase, Isocitrat-Dehydrogenase und Fumarat-Hydratase des Citrat-Zyklus konnten enzymologisch untersucht werden, was auf eine geringe metabolische Aktivit{\"a}t im Citrat-Zyklus hinweist. M{\"o}glicherweise dient der erste Teil des Citrat-Zyklus nur der Einf{\"u}hrung von Aminos{\"a}uren als Kohlen- und Stickstoffquelle in den Metabolismus. Unter anaeroben Bedingungen wird die Glucose in der Glycolyse und der gemischten S{\"a}ureg{\"a}rung zu Lactat und Ethanol umgesetzt. Hohe spezifische Enzymaktivit{\"a}ten der Lactat- und Alkohol-Dehydrogenase konnten nachgewiesen werden. Die Energie in Form von ATP wird auch in dieser Phase des Wachstums durch Substratkettenphosphorylierung generiert. Bacillus subtilis 168 (B. subtilis 168) ist ein grampositives apathogenes Bakterium, das durch die Zugabe von Pyruvat auch zum Wachstum unter sauerstofffreien Bedingungen bef{\"a}higt ist. Es exprimiert Enzyme der 2,3-Butandiol- und Lactatfermentation. In der hier vorliegenden Arbeit wurden die enzymkatalytischen Eigenschaften von Enzymen des Intermedi{\"a}r- und Fermentationsstoffwechsels untersucht. In der logarithmischen Wachstumsphase wird die Glucose {\"u}ber die Glycolyse verstoffwechselt. Wie bei S. aureus COL ist der Eintritt des Glucose-6-phosphates in den Pentose-Phosphat-Weg aufgrund einer h{\"o}heren spezifischen Enzymaktivit{\"a}t der Glucose-6-phosphat-Isomerase limitiert. Die Energie in Form von ATP wird auch hier haupts{\"a}chlich {\"u}ber Substratkettenphosphorylierungsreaktionen generiert. Die Bedeutung der Lactat-Dehydrogenase-Aktivit{\"a}t unter aeroben Bedingungen ist noch nicht eindeutig gekl{\"a}rt, jedoch kann davon ausgegangen werden, dass auch hier ein Teil des Pyruvates zur Regeneration von NAD+ durch die Lactat-Dehydrogenase umgesetzt wird. Unter anaeroben Bedingungen wurden hohe Lactat-Dehydrogenasen-Aktivit{\"a}ten gemessen. Au{\"s}erdem wird die Glucose zur Regeneration von NAD+ zu D-2,3-Butandiol fermentiert. Zusammenfassend ist zu sagen, dass enzymologische Untersuchungen und die Erforschung der spezifischen Enzymaktivit{\"a}ten unter bestimmten Bedingungen ein gutes Hilfsmittel f{\"u}r metabolische Studien ist und diese gut mit vorhandenen Proteom- und Metabolomdaten verglichen werden k{\"o}nnen. Enzymanalysen sind nicht einfach handhabbar, bieten aber die M{\"o}glichkeit, einen Blick in die Physiologie von Mikroorganismen zu werfen. F{\"u}r ein allumfassendes Verst{\"a}ndnis ist es wichtig, Enzymaktivit{\"a}ten zu untersuchen.}, language = {de} }