@phdthesis{Ramp2012,
  author    = {Kristina Ramp},
  title     = {Rekombinante Newcastle Disease Viren f{\"u}r die Entwicklung von Markervakzinen- M{\"o}glichkeit der simultanen Impfung gegen die Newcastle Krankheit und die Avi{\"a}re Influenza},
  journal    = {Recombinant Newcastle Disease Viruses for the development of marker vaccines- a possibility to vaccinate simultaneously against Newcastle disease and Avian influenza},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001214-9},
  year      = {2012},
  abstract  = {Zwei bedeutende Erkrankungen des Wirtschaftsgefl{\"u}gels, die weltweit zu hohen Verlusten f{\"u}hren k{\"o}nnen, sind die Newcastle Krankheit und die avi{\"a}re Influenza. Mit der Verf{\"u}gbarkeit des reversen genetischen Systems f{\"u}r das Newcastle Disease Virus (NDV) wurde es m{\"o}glich, NDV als Vektor f{\"u}r einzelne Proteine, z.B. des avi{\"a}ren Influenzavirus (AIV) zu nutzen und so Viren zu generieren, die als Impfvirus gegen beide Krankheiten einen Schutz vermitteln. Um zu untersuchen, ob die Insertionsposition eines Transgens in das NDV-Genom einen Einfluss auf die H{\"o}he der Expression des Fremdproteins hat, wurde das H{\"a}magglutinin-Protein (HA)-Gen eines hochpathogenen (HP) AIV Isolates in die intergene Region zwischen den Genen f{\"u}r das Phosphoprotein (P) und das Matrixprotein (M), M und das Fusionsprotein (F) oder F und des H{\"a}magglutinin-Neuraminidase Proteins (HN) des attenuierten NDV Clone 30 inseriert. Zus{\"a}tzlich wurden Virusrekombinanten untersucht, die ein HPAIV Neuraminidase (NA)-Gen zwischen den NDV Genen F und HN alleine oder in Kombination mit dem HA im Insertionsort zwischen NDV P und M trugen. Die Quantifizierung der Expression der HA- und NA-spezifischen mRNA wurde mit Hilfe der Northern Blot Analyse durchgef{\"u}hrt. Die HA-Proteine wurden zus{\"a}tzlich durch die Massenspektrometrie identifiziert und durch die SILAC (stable isotope labelling with amino acids in cell culture)-Technik quantifiziert. Dabei zeigte sich, dass die HA Expression auf Transkript- und Proteinebene am h{\"o}chsten war, wenn das HA-Gen zwischen NDV F und HN inseriert wurde, sich jedoch nur moderat von den anderen untersuchten Insertionsorten unterschied. Daraus kann gefolgert werden, dass die Wahl der intergenen Region zum Einbau des Fremdgens im Genomabschnitt zwischen P und HN nur einen geringf{\"u}gigen Einfluss auf dessen Expression hat. Durch die simultane Integration von HA und NA in das NDV-Genom konnte dar{\"u}ber hinaus gezeigt werden, dass NDV zwei Transgene und damit eine Vergr{\"o}{\"s}erung des Gesamtgenoms um {\"u}ber 3 kb toleriert und dabei effizient repliziert Zus{\"a}tzlich wurde untersucht, ob die gleichzeitige Insertion des NA- und HA-Gens zu einer Steigerung der Immunantwort und folglich zu einem verbesserten Schutz vor einer hoch virulenten avi{\"a}ren Influenzainfektion f{\"u}hrt. Dazu wurden drei verschiedene NDV/AIV Rekombinanten generiert, bei denen das HA-Gen zwischen NDV P und M und/oder das NA-Gen zwischen NDV F und HN inseriert wurden. Die Schutzwirkung der Rekombinanten wurde gegen drei verschiedene HPAIV des H5 Subtyps in H{\"u}hnern bestimmt. Hierbei zeigte sich, dass die Schutzwirkung vor einer letalen HPAIV-Infektion durch die Insertion beider AIV Oberfl{\"a}chenproteingene in das NDV Genom nicht besser war als bei alleiniger AIV HA Expression. Daraus kann geschlossen werden, dass die NA-Antik{\"o}rper nur einen geringen Beitrag bei der Abwehr einer HPAIV Infektion leisten. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden durch die Sequenzierung des Gesamtgenoms des lentogenen Impfvirus Clone 30 mit Hilfe des Genome Sequenzers (Roche) neun Sequenzunterschiede im Vergleich zum urspr{\"u}nglichen rekombinanten NDV (rNDV) detektiert. Durch Mutagenese der betreffenden Nukleotide konnte ein NDV generiert werden, das in seiner Sequenz dem Wildtypvirus Clone 30 entspricht. Die Virulenz und Eignung als in ovo Impfvirus des resultierenden Virus (rNDVGu) wurde im Vergleich zu den Virusrekombinanten rNDV, rNDV49, das durch einzelne Punktmutationen im F- und HN-Gen charakterisiert ist, und dem Wildtypvirus NDV Clone 30 untersucht. Bei der Bestimmung der Virulenz durch Ermittlung des intracerebalen Pathogenit{\"a}tsindex (ICPI) konnte eine Reihung der Viren mit abnehmender Virulenz vorgenommen werden: NDV Clone 30 > rNDVGu > rNDV ~ rNDV49. Die geringere Virulenz des rNDVGu im Vergleich zum Ausgangsvirus Clone 30 deutet auf das Vorhandensein von Unterspezies in dem plaquegereinigtem NDV Clone 30 und die daraus resultierende Beeinflussung der Virulenzeigenschaften hin. Nach in ovo Applikation der drei hergestellten rekombinanten NDV und des Wildtypvirus NDV Clone 30 konnte gezeigt werden, dass das Wildtypvirus f{\"u}r H{\"u}hnerembryonen eine h{\"o}here Virulenz besitzt als die Virusrekombinanten. Die geschl{\"u}pften K{\"u}ken waren vor einer Infektion mit hochpathogenem NDV gesch{\"u}tzt, jedoch entsprachen die Schlupfraten nicht den Anforderungen f{\"u}r eine in ovo Vakzine. Diese Untersuchungen zeigten aber auch, dass mit Hilfe der in ovo Applikation eine deutlichere Unterscheidung der Restvirulenz lentogener NDV mit {\"a}hnlichen ICPI-Werten m{\"o}glich ist.},
  language  = {de}
}