@phdthesis{Muntel2011,
  author    = {Jan Muntel},
  title     = {Entwicklung und Etablierung von Massenspektrometrie-basierten relativen und absoluten Quantifizierungsmethoden zur physiologischen Proteomanalyse Gram positiver Bakterien},
  journal    = {Development and establishment of mass spectrometry based relative and absolute quantification methods for physiological proteome analysis of Gram positive bacteria},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001099-7},
  year      = {2011},
  abstract  = {Massenspektrometrie hat sich zur Methode der Wahl f{\"u}r die globale relative und absolute Proteinquantifizierung entwickelt. Da das vorhandene Methodenspektrum in der Anzahl der zu analysierenden Proben limitiert ist und bei der Vermeidung von Vorfraktionierungstechniken keine globale Analyse erlaubt, war es das Ziel dieser Dissertation das Methodenspektrum anhand von anschaulichen Beispielen zur physiologischen Proteomanalyse Gram positiver Bakterien zu erweitern. Dazu erstreckt sich diese Arbeit von der Erweiterung der Anwendungsm{\"o}glichkeiten der Isotopen markierten relativen Quantifizierungsmethode, {\"u}ber die Entwicklung eines globalen markierungsfreien relativen Quantifizierungsansatzes bis zur globalen absoluten Quantifizierung und weiter im speziellen der St{\"o}chiometrie-Aufkl{\"a}rung eines Proteinkomplexes. Die Kombination aus 14N/15N metabolischer Markierung mit der GeLC-MS Technik erlaubt eine robuste relative Quantifizierung auf globaler Ebene. Durch die Verwendung eines internen 15N-markierten Referenzextraktes wurde eine bisher nicht erreichte zeitliche Aufl{\"o}sung von zehn Zeitpunkten bei der Untersuchung eines N{\"a}hrstoffwechsels zwischen den bevorzugten Kohlenstoffquellen, Glukose und Malat, des Gram positiven Modellorganismus Bacillus subtilis erreicht. Dieses Experiment zeigte klar, dass die Anpassung an Malat als zweite Kohlenstoffquelle sehr schnell passiert. Im Gegensatz dazu findet die Anpassung an Glukose als zus{\"a}tzliche Kohlenstoffquelle mit einer zeitlichen Verschiebung von ca. 45 Min. statt. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass die Anpassung an Malat haupts{\"a}chlich auf post-transkriptioneller Ebene geschieht und die Anpassung an Glukose auf transkriptioneller Ebene stattfindet. Die geringe Reproduzierbarkeit von Vorfraktionierungstechniken beschr{\"a}nkt ihre Anwendung w{\"a}hrend einer markierungsfreien Quantifizierung. Die eingeschr{\"a}nkte Kombinationsm{\"o}glichkeit mit Vorfraktionierungstechniken f{\"u}hrt zu einer geringeren Anzahl an identifizierten und quantifizierten Proteinen, was durch den Einsatz von Ausschlusslisten mit optimierten Messparametern in wiederholten Messungen mit einer eindimensionalen Chromatographie ausgeglichen wurde. Im Vergleich zu einer einfachen Wiederholung der Messung konnte die Anzahl an identifizierten Peptiden um 32 \% gesteigert werden. Der Ausschlusslistenansatz konnte anschlie{\"s}end erfolgreich f{\"u}r eine markierungsfreie globale Proteinquantifizierung der Stickstoffmonoxid (NO) Stressantwort des humanpathogenen Stapylococcus aureus eingesetzt werden. Die Ergebnisse wurden mittels paralleler Quantifizierung mit 14N/15N metabolischen Markierung verifiziert. Mit dem Ansatz wurden fast 50 \% des gesamten Proteoms identifiziert und 70 \% davon konnten mit einem zu dem Markierungsexperiment vergleichbaren Ergebnis quantifiziert werden. Die Proteomsignatur der NO-Stressantwort zeigte eine hohe {\"A}hnlichkeit zu der von Antibiotika, die wie NO zu DNA-Strangbr{\"u}chen f{\"u}hren. Auch bei der absoluten Proteinquantifizierung kann nicht ohne Weiteres eine Vorfraktionierung eingesetzt werden. Durch die Verwendung einer „multiplexed LC-MS“ (LC-MSE) Methode wurde fast die H{\"a}lfte aller zytosolischen Proteine von B. subtilis mit einer hohen durchschnittlichen Sequenzabdeckung von 40 \% identifiziert. Die Hi3-Methode erm{\"o}gliche zus{\"a}tzlich die absolute Quantifizierung fast aller identifizierten Proteine, die {\"u}ber fast vier Gr{\"o}{\"s}enordnungen nachgewiesen werden konnten. Die Zuverl{\"a}ssigkeit des Ansatzes wurde f{\"u}r sechs Proteine mit der gut etablierten AQUA-Technik best{\"a}tigt. Mit der Hi3-Methode wurden zum einen absolute Proteomsignaturen f{\"u}r unterschiedliche N{\"a}hrstoffsituationen erstellt, was auch Einblicke in die Regulation der Expression von Aminos{\"a}ure-Biosynthese und –abbau-Enzyme erm{\"o}glichte. Zum anderen konnte gezeigt werden, dass die intrazellul{\"a}re Konzentration von ribosomalen und weiteren Wachstumsraten-abh{\"a}ngig ben{\"o}tigten Proteinen sich bei niedrigen Wachstumsraten nicht unterscheidet und erst ab einer Wachstumsrate von 0,8 Std.-1 linear ansteigt. Die vergleichsweise hohe Standardabweichung der Hi3-Methode (~30 \%) erschwert ihre Anwendung bei der Bestimmung von nicht gradzahligen Protein-Komplex-St{\"o}chiometrien. Deswegen wurde zur Analyse des RNA-Polymerase-Komplexes von B. subtilis der AQUA-Ansatz gew{\"a}hlt, der sich durch eine sehr geringe Standardabweichung auszeichnet (< 10 \%). Dazu wurde ein Protokoll entwickelt, welches auf einer mTRAQ-Markierung der Referenzpeptide und des verdauten Komplexes beruhte. Es war so m{\"o}glich die bekannte St{\"o}chiometrie des Kernkomplexes RpoA:RpoB:RpoC 2:1:1 zu best{\"a}tigen und zus{\"a}tzlich die zwei ω-Unterheiten und die σ-Faktoren σA und σB absolut zu bestimmen. Die Menge an σB im Komplex nahm nach Glukose-Hunger und Ethanol-Stress auf bis zu 5 \% zu und es konnte gezeigt werden, dass sich die Menge einer ω-Unterheit (YloH) sich im gleichen Ma{\"s}e im Komplex {\"a}ndert, wie die Menge an σA.},
  language  = {de}
}