@phdthesis{Scheffter2017, author = {Robert Scheffter}, title = {Herstellung und Evaluierung eines zweifach attenuierten sowie eines dualen Influenza-A-Lebendimpfstoffkandidaten im Maus- und Schweinemodell}, journal = {Development and evaluation of a double-attenuated and a bivalent live vaccine against influenza A virus}, url = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002943-3}, year = {2017}, abstract = {Trotz der Verf{\"u}gbarkeit von verschiedenen Impfstoffen z{\"a}hlen Influenza-A-Viren (IAV) nach wie vor zu den gef{\"a}hrlichsten humanpathogenen Krankheitserregern weltweit. Ebenso verursachen einige animale IAV-St{\"a}mme bei zahlreichen Wild- und Nutztierarten schwerwiegende und teilweise t{\"o}dlich verlaufende Infektionen. Daher ist die Entwicklung moderner und effektiver Impfstoffe gegen IAV f{\"u}r die Tier- und Humanmedizin von gr{\"o}{\"s}ter Wichtigkeit. Im ersten Teil der Arbeit wurde auf Basis des IAV-Stamms A/Bayern/74/2009 (pH1N1) eine doppelt-attenuierte IAV-Mutante, genannt BY74-NS1-99-E, mit einem Elastase-sensitiven HA-Spaltmotiv und einer C-terminalen Verk{\"u}rzung des Interferon-Antagonisten NS1 generiert und hinsichtlich ihrer Eignung als IAV-Lebendimpfstoff untersucht. In vitro zeigte sich BY74-NS1-99-E streng Elastase-abh{\"a}ngig und replizierte ausschlie{\"s}lich unter dessen Zugabe zu {\"a}hnlich hohen Titern wie der Wildtyp unter Zugabe von Trypsin. Aufgrund der geringen Elastase-Verf{\"u}gbarkeit in vivo war die Mutante in ihrer Replikationsf{\"a}higkeit stark eingeschr{\"a}nkt und zeigte sich im Gegensatz zum Wildtyp sowohl im Mausmodell als auch im Schwein vollkommen apathogen. In der Maus f{\"u}hrte die einmalige intranasale Applikation von BY74-NS1-99-E zu einer deutlichen Bildung von H1-spezifischen Serumantik{\"o}rpern. Ihr Auftreten korrelierte mit dem Schutz der M{\"a}use gegen eine Belastungsinfektion mit dem homologen Wildtyp-Virus. W{\"a}hrend eine singul{\"a}re Immunisierung mit einer Dosis von 106 TCID50 BY74-NS1-99-E komplett vor einer Replikation des homologen Belastungsvirus sch{\"u}tzte, verhinderten Dosen ab 104 TCID50 die Ausbildung klinischer Symptome, einen Gewichtverlust und reduzierten die pulmonale Viruslast. Im Schwein erwies sich die Mutante als wenig immuogen. So lie{\"s} sich selbst nach zweifacher intranasaler Applikation mit der Mutante keine H1- oder NP- spezifische Antik{\"o}rper-Antwort nachweisen. Um k{\"u}nftig leichter Fragen zum Zelltropismus und zur Virusausbreitung auch in Echtzeit sowohl in vitro als auch in vivo untersuchen zu k{\"o}nnen, wurde im Rahmen des zweiten Teils der Arbeit ein replikationsf{\"a}higes IAV mit einem membranst{\"a}ndigen eGFP generiert. Die Strategie zur Herstellung des rekombinanten, Fremdgen exprimierenden Virus, basierte auf einer Ver{\"o}ffentlichung von Gao et al. (2010), in welcher ein IAV mit einem zus{\"a}tzlichen neunten Gen-Segment beschrieben wird. Bei den in vitro Untersuchungen zum Wachstumsverhalten der mittels reverser Genetik hergestellten Mutante BY74-eGFP, wurde eine im Vergleich zum parentalen Wildtyp verminderte Replikationseffizienz festgestellt. Genetisch zeigte sich BY74-eGFP weitgehend stabil. Die Ergebnisse der Western-Blots sowie die Immunf{\"a}rbungen zur konfokalmikroskopischen Auswertung deuteten stark auf eine Inkorporation des NA-eGFP-Fusionsproteins in die virale Membran der Mutante hin. Ein solches Reportergen-exprimierendes Virus k{\"o}nnte zuk{\"u}nftig als molekulares Werkzeug bei der Untersuchung und Aufkl{\"a}rung der genauen Verl{\"a}ufe einer IAV-Infektion in vitro und in vivo dienen. Ziel des dritten Teils dieser Arbeit war es, auf Grundlage der Arbeiten von Gao et al. (2010) und Stech et al. (2005), ein Elastase-abh{\"a}ngiges IAV, welches zwei verschiedene H{\"a}magglutinine (H1 und H3) exprimiert, zu generieren und auf seine Eignung als LAIV im Mausmodell zu untersuchen. Als Basis f{\"u}r das generierte Neunsegmentvirus BY74-H1H3-E diente der Stamm A/Bayern/74/09 (pH1N1). Das zus{\"a}tzlich bereitgestellte neunte Gensegment codierte f{\"u}r das H3-HA des Stammes A/Swine/Bissendorf/IDT1864/2003 (H3N2) (SB03). Bei den In-Vitro-Untersuchungen zur Expressions-Stabilit{\"a}t konnte zwar zun{\"a}chst eine schwache H3-HA-Expression in den infizierten Zellen beobachtet werden, jedoch reduzierte sich diese von Passage zu Passage und verschwand letztendlich. Die Genomanalyse zeigte, dass das H3-tragende Gensegment letztlich verloren ging. Im Vergleich zum Wildtyp wies das potentielle Impfvirus in vitro eine stark verringerte Replikationsf{\"a}higkeit auf. Im Mausmodell erwies sich die BY74-H1H3-E-Mutante im Gegensatz zu A/Bayern/74/09 (pH1N1) und A/Swine/Bissendorf/IDT1864/2003 (H3N2) als vollkommen apathogen. Eine zweifache intranasale Immunisierung mit 103 TCID50 der dualen Virusmutante induzierte eine deutliche H1-spezifische und zum Teil eine moderate H3-spezifische Antik{\"o}rper-Antwort. Sie sch{\"u}tzte die Tiere bei einer homologen Belastungsinfektion BY74-Wildtyp (H1N1) komplett vor einem Gewichtsverlust und der Ausbildung klinischer Symptome. Bei einer heterosubtypischen Belastungsinfektion mit SB03-Wildtyp (H3N2) reduzierte sie den Gewichtsverlust und die klinischen Symptome. Die Doppelimmunisierung f{\"u}hrte sowohl bei den Tieren, die einer homologen als auch bei den Tieren die einer heterologen Belastungsinfektion unterzogen worden waren zu einer Reduktion der pulmonalen Viruslast. Insgesamt erf{\"u}llte BY74-H1H3-E die Anforderungen eines potentiellen dualen LAIV-Kandidaten nur bedingt.}, language = {de} }