@phdthesis{Peters2015,
  author    = {Christin Peters},
  title     = {Kopplung von Oxidoreduktasen in synthetischen Enzymkaskaden},
  journal    = {Coupling of oxidoreductases in synthetic enzyme cascades},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002328-9},
  year      = {2015},
  abstract  = {Der gesamte Zellmetabolismus besteht aus einem effektiven System an Enzymkaskaden, um das Leben zu erm{\"o}glichen. Hier werden Stoffe ohne Abtrennung oder Aufarbeitung {\"u}ber verschiedene Intermediate selektiv zum Produkt umgesetzt. Die Ersparnis an Zeit, Kosten und Abfall durch den Wegfall von Reinigungen der Zwischenprodukte und der direkte Umsatz von toxischen oder instabilen Intermediaten zum Produkt machen Kaskadenreaktionen zu einem aktuellen und interessanten Anwendungsbereich der Biotechnologie. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte erfolgreich eine in vivo Enzymkaskade aus drei Oxidoreduktasen etabliert, untersucht und mit Fusionsproteinen verbessert werden. Zur Etablierung der in vivo Enzymkaskade aus Alkoholdehydrogenase, Enoatreduktase und Baeyer-Villiger-Monooxygenase im Rahmen eines DFG-Projekts (Bo1862/6-1) in Zusammenarbeit mit der Technischen Universit{\"a}t Wien wurde zun{\"a}chst nach den geeigneten Enzyme gesucht. Mit einer Alkoholdehydrogenase aus Laktobacillus kefir und einer Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus ruber konnte eine Oxidation von chiralen Cyclohexenol-Derivaten und Carveolen zu den entsprechenden prochiralen Ketonen erfolgen. Im Rahmen der Suche nach geeigneten Enzymen f{\"u}r die Kaskade wurde von drei neuen Enoatreduktasen aus Pseudomonas putida ATCC 17453 das Substratspektrum untersucht. Die xenobiotische Reduktase A (XenA), die xenobiotische Reduktase B (XenB) und die N-Ethylmaleimid-Reduktase (NemA) akzeptierten sowohl aliphatische als auch cyclische Ketone und Aldehyde. Sehr gute Ums{\"a}tze konnten mit Imiden und Carvonen nachgewiesen werden. Besonders die XenA und XenB zeigten mit {\"u}ber 99 \% Enantiomeren{\"u}berschuss in der Bildung von Dihydrocarvonen exzellente Stereoselektivit{\"a}ten. In der Enzymkaskade setzten dann die XenB oder das Old yellow enzyme (OYEI) die α,β-unges{\"a}ttigen Ketone selektiv zu den chiralen Ketonen um. Diese wurde dann von der Cyclohexanon-monooxygenase (CHMO) aus Acinetobacter species in die gew{\"u}nschten chirale Laktone umgesetzt. Nach erfolgreichen Klonierungen konnten alle vier Enzymkombinationen der Enzymkaskade l{\"o}slich und aktiv in einem E. coli-Stamm kultiviert werden. Mit der Kombination verschiedener nicht-nat{\"u}rlich verbundener Biokatalysatoren konnten in vivo Cyclohexenol und einfach Methyl-substituierte Cyclohexenol-Derivate selektiv zu chiralen Laktonen umgesetzt werden. Wir konnten durch Auswahlm{\"o}glichkeiten zwischen verschiedenen Alkoholdehydrogenasen und Enoat-reduktasen modular agieren und so zum Beispiel innerhalb von 20 Stunden die Reaktion von 4 Methyl-2-cyclohexenol zu 100 \% in das optisch reine Lakton in E. coli katalysieren. Auch die f{\"u}r die Polymerindustrie interessanten Dihydrochalconlaktone konnten mit sehr guten Ums{\"a}tzen und mit {\"u}ber 99 \%ee hergestellt werden. Nach der erfolgreichen Etablierung der Enzymkaskade wurde die Umsatzgeschwindigkeit mit Hilfe von Fusionsproteinen noch einmal gesteigert. Daf{\"u}r wurde die Auswirkung von verschiedenen Linkern und die Abfolge der Enzymdom{\"a}nen im Fusionsprotein aus XenB-Dom{\"a}ne und CHMO-Dom{\"a}ne untersucht. Mit dem Fusionsproteine CHMO\_G\_XenB konnte nach einer Stabilisierung der CHMO-Dom{\"a}ne ein sehr guter Biokatalysator hergestellt werden. Anwendungen in der in vivo Enzymkaskade zeigten schnellere Ums{\"a}tze f{\"u}r Cyclohexenol und Carveol. Ein aktives Fusionsprotein aus Alkoholdehydrogenase, XenB und CHMO konnte nicht etabliert werden, da beide Alkoholdehydrogenasen aus der Enzymkaskade bei der Fusionierung inaktiviert wurden. Auch wenn kein aktives Fusionsprotein aus drei verschiedenen Enzymdom{\"a}nen hergestellt werden konnte, ist mit der erstmaligen Fusion einer Enoatreduktase und einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase die neue in vivo Enzymkaskade verbessert worden. Somit konnte in dieser Doktorarbeit die erfolgreiche Anwendung von einer modularen in vivo Enzymkaskaden f{\"u}r die Herstellung chiraler Laktone f{\"u}r die Polymerchemie gezeigt werden.},
  language  = {de}
}