@phdthesis{Rauter2015, author = {Marion Rauter}, title = {Herstellung rekombinanter Alkoholdehydrogenasen in der Hefe Arxula adeninivorans und ihre Verwendung f{\"u}r die Synthese enantiomerenreiner Alkohole}, journal = {Production of recombinant alcohol dehydrogenases in the yeast Arxula adeninivorans and their application for the synthesis of enantiomerically pure alcohols}, url = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002229-9}, year = {2015}, abstract = {Die ADHs aus Rhodococcus ruber (RrADH) und Lactobacillus brevis (LbADH) wurden erstmals in der Hefe Arxula adeninivorans (Blastobotrys adeninivorans) hergestellt und zur Synthese von enantiomerenreinen 1-Phenylethanol eingesetzt. Die entsprechenden Gene wurden hierf{\"u}r mit dem starken konstitutiven TEF1-Promotor und dem PHO5-Terminator flankiert und unter Nutzung der etablierten Xplor2®-Transformations-/Expressionsplattform in der Hefe exprimiert. Die erhaltenen selektierten Transformanden wiesen dabei ADH-Aktivit{\"a}ten von 21 bzw. 320 U g-1 dcw f{\"u}r die Reduktion von Acetophenon zu 1-Phenylethanol in Sch{\"u}ttelkultur auf. RrADH und LbADH sind f{\"u}r die Reduktion von Acetophenon und Acetophenon-Derivaten, alpha-Ketoestern und aliphatischen Ketonen geeignet. Die RrADH synthetisiert (S)-konfigurierte Alkohole und ist NAD+/NADH-abh{\"a}ngig, w{\"a}hrend die LbADH die Reduktion von Acetophenon zu 1-(R)-Phenylethanol mithilfe des Cofaktors NADPH katalysiert. Rohextrakt des RrADH produzierenden Hefestamms konnte erfolgreich f{\"u}r die Synthese von enantiomerenreinem 1-(S)-Phenylethanol mit einer Ausbeute von 90 \% und einem Enantiomeren{\"u}berschuss (ee) von >99 \% {\"u}ber Substrat-gekoppelte Regeneration mit Isopropanol eingesetzt werden. Die Erh{\"o}hung der Ausbeute auf 100 \% gelang durch Enzym-gekoppelte Regenerierung des Cofaktors NADH mit der GDH aus Bacillus megaterium (Bm) f{\"u}r RrADH bzw. NADPH mit der BmGDH und G6PDH aus Bacillus pumilus (Bp) f{\"u}r LbADH katalysierte Reaktionen. ADHs und Cofaktor-regenerierende Enzyme wurden simultan durch die konstitutive Coexpression der entsprechenden Gene in A. adeninivorans f{\"u}r die Synthese von enantiomerenreinem 1-Phenylethanol hergestellt. Die Enzymrohextrakte der RrADH-BmGDH, LbADH-BmGDH und LbADH-BpG6PDH produzierenden Hefest{\"a}mme katalysieren ohne Ausnahme die Synthese des jeweiligen Enantiomers von 1-Phenylethanol mit ee >99 \% und Ausbeuten von 100 \% f{\"u}r Substratkonzentrationen bis 40 mM. Nach der Extraktion des 1-Phenylethanols liegt dieses chemisch rein vor, sodass aufwendige Aufarbeitungs- und Reinigungsschritte erspart bleiben. GDH bzw. G6PDH sind hervorragend f{\"u}r die Regeneration von NADH und NADPH bzw. ausschlie{\"s}lich letzterem geeignet. Dabei wurden standardm{\"a}{\"s}ig 40 mol 1-Phenylethanol pro Mol NAD+ oder NADP+ erreicht. Auch intakte Hefezellen der rekombinanten ADH und BmGDH bzw. BpG6PDH synthetisierenden St{\"a}mme wurden f{\"u}r die Synthese von 1-(S)- bzw. 1-(R)-Phenylethanol verwendet. Nach Permeabilisierung mit Triton X-100 wiesen sie vergleichbare Aktivit{\"a}ten zu den entsprechenden Rohextrakten auf. Der RrADH-BmGDH produzierende Stamm synthetisiert 1-(S)-Phenylethanol mit einer Aktivit{\"a}t von 20 U g-1 dcw, w{\"a}hrend die LbADH-BmGDH und LbADH-BpG6PDH Hefest{\"a}mme sogar 45,6 und 87,9 U g-1 dcw lieferten. Die Ausbeuten und ee waren im Vergleich zu den Rohextrakten {\"a}hnlich. Die Erh{\"o}hung der Konzentration des Ausgangsstoffs Acetophenon reduzierte unabh{\"a}ngig von den verwendeten Enzymen die erhaltene Ausbeute. Die katalytische Produktivit{\"a}t der Biokatalysatoren wurde durch ihre Wiederverwendung erh{\"o}ht. Hierf{\"u}r wurden permeabilisierte Zellen, die einfach aus der Synthesel{\"o}sung abzentrifugiert werden k{\"o}nnen, genutzt. Au{\"s}erdem konnten der Rohextrakt und die Zellen nach ihrem Einschluss in unl{\"o}sliches Calciumalginat in Form von kleinen K{\"u}gelchen aus der Synthese abfiltriert und wiederverwendet werden. Permeabilisierte Zellen und Immobilisate wurden wiederholt f{\"u}r die Reduktion von Acetophenon zu 1-Phenylethanol eingesetzt, wobei immobilisierter Rohextrakt und Zellen f{\"u}r drei bis maximal sechs Synthesezyklen verwendet werden konnten. Immobilisierte und permeabilisierte Zellen sind wesentlich stabiler. Sie k{\"o}nnen ohne erhebliche Aktivit{\"a}tsverluste 14 (LbADH-BpG6PDH), 29 (RrADH-BmGDH) bzw. mehr als 50 Mal (LbADH-BmGDH) wiederholt zur Acetophenon-Reduktion eingesetzt werden. Auf ihrer Grundlage wurde ein erster Reaktor f{\"u}r die semi-kontinuierliche Synthese von 1-(R)-Phenylethanol im Laborma{\"s}stab konstruiert und in Betrieb genommen. Es konnten 206 mol 1-(R)-Phenylethanol pro Mol NADP+ und 12,78 g 1-(R)-Phenylethanol mit einem ee von 100 \% und einer Raum-Zeit-Ausbeute von 9,74 g L-1 d-1 oder 406 g kg-1 dcw d-1 erhalten werden. Weitere Optimierungen der Hefest{\"a}mme, Reaktionsbedingungen und Reaktionsf{\"u}hrung sind zur Erh{\"o}hung der Ausbeute und zum Erreichen vergleichbarer Produktivit{\"a}t mit derzeitigen Syntheseprozessen f{\"u}r 1-Phenylethanol n{\"o}tig. Der ee ist bereits optimal. Zusammenfassend ist A. adeninivorans ein hervorragender Wirt zur Herstellung von ADHs f{\"u}r die Synthese enantiomerenreiner Alkohole wie 1-(S)- und 1-(R)-Phenylethanol. Nach Extraktion liegt das Produkt rein und mit optimalen ee vor. Durch die in dieser Arbeit gezeigten Untersuchungen k{\"o}nnen bisher chemische Synthesen durch enzymatische Reaktionen unter Einsatz von ADHs, deren Produktion in A. adeninivorans erfolgte, ersetzt werden, was Kosten und nat{\"u}rlichen Ressourcen spart.}, language = {de} }