@phdthesis{Haertel2011,
  author    = {Tobias H{\"a}rtel},
  title     = {Aufkl{\"a}rung grundlegender Aminos{\"a}uresynthesewege von Streptococcus pneumoniae mittels Isotopolog Profiling und Einfluss des Glutaminmangels auf die bakterielle Virulenz},
  journal    = {Characterization of amino acid synthesis pathways of streptococcus pneumoniae by isotopologue profiling and the impact of glutamine on bacterial virulence},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001106-9},
  year      = {2011},
  abstract  = {Als Mitglieder der Ordnung Lactobacillales ist das Hauptkatabolit der Pneumokokken sowohl unter aerober wie auch microaerophiler Atmosph{\"a}re Lactat. Des Weiteren synthetisiert S. pneumoniae eine gro{\"s}e Bandbreite an ABC-Transportersystemen, die an der Assimilation und an dem Stoffwechsel von Kohlenhydraten, l{\"o}slichen Verbindungen und Aminos{\"a}uren beteiligt sind. In dieser Arbeit wurde der Kohlenstoffmetabolismus mittels 13C-Isotopologen Verteilung nach Wachstum der Pneumokokkenkultur in chemisch definiertem Medium (CDM) mit [U-13C6]Glucose, [1,2-13C2]Glucose oder [U-13C2]Glycin analysiert. GC/MS-Analysen zeigten ein Muster an schwer-markierten und unmarkierten Kohlenstoffatomen in den Aminos{\"a}uren. Die Ergebnisse lie{\"s}en den Schluss zu, dass Pneumokokken sowohl einzelne Aminos{\"a}uren aufnehmen, wie auch {\"u}ber klassische oder nicht-klassische Biosynthesewege de novo synthetisieren k{\"o}nnen. His, Glu, Ile, Leu, Val, Pro und Gly blieben im Isotopolog Profiling unmarkiert, was ein Hinweis auf das Fehlen von Biosynthesewegen oder ihrer Regulation unter bestimmten Umweltbedingungen sein k{\"o}nnte. Obwohl die genetische Information f{\"u}r die Biosynthese der essentiellen verzweigtkettigen Aminos{\"a}uren (BAA; Ile, Leu und Val) in S. pneumoniae vorhanden ist, ergaben die 13C-Markierungsversuche keine de novo Synthese. Jedoch konnte durch Langzeit-1H-NMR (LT-NMR) Analysen eine aktive Aufnahme dieser Aminos{\"a}uren nachgewiesen werden. Dar{\"u}ber hinaus wird Aspartat nicht {\"u}ber den allgemeinen Stoffwechselweg mit Pyruvat und Acetyl-CoA synthetisiert. Die Aspartat-Synthese erfolgt im ersten Schritt durch die Umwandlung von Phosphoenolpyruvat (PEP) und CO2 zu Oxalacetat. Im zweiten Schritt wird Oxalacetat dann in Aspartat mit der Nebenreaktion Glutamat zu alpha-Ketoglutarat durch die Aspartat-Transaminase metabolisiert. GC/MS Analysen ergaben weiterhin, dass komplett markierte aromatische Aminos{\"a}uren aus Erythrose-4-Phosphat und zwei Molek{\"u}len PEP {\"u}ber das Intermediat Chorismat synthetisiert wurden. Es zeigte sich au{\"s}erdem, dass [M+1] markiertes Serin durch die Hydroxymethylierung von unmarkiertem Glycin {\"u}ber 5,10-Methylentetrahydrofolat als Teil des C1-Pools hergestellt wurde. Weiterhin wurden In LT-NMR-Untersuchungen Konzentrations{\"a}nderungen der extrazellul{\"a}ren Metabolite quantifizert. Die homofermentative Milchs{\"a}ureg{\"a}rung konnte in Pneumokokken durch einen extrazellul{\"a}ren Anstieg der Lactatkonzentration nachgewiesen werden. Als essentielle Kandidaten wurden Glutamin und Uracil identifiziert, die das Pneumokokkenwachstum bei Mangel einschr{\"a}nken. Diese Ergebnisse zeigen die Vielzahl von Aminos{\"a}uren-Synthesewegen in Pneumkokken und die notwendige Rolle der Transportersysteme in Pneumokokken f{\"u}r die bakterielle Fitness und f{\"u}r die Adaption an verschiedene Wirtsnischen. Sechs m{\"o}gliche Glutamin-Aufnahmesysteme konnten durch Genomanalysen von Streptococcus pneumoniae St{\"a}mmen identifiziert werden. Die Reverse Transkriptions-PCR haben gezeigt, dass die sechs gln-Operons unter in vitro Bedingungen exprimiert werden. Vier der gln-Gencluster bestehen aus den Genen glnQPH, w{\"a}hrend in zwei Regionen das Gen glnH, welches f{\"u}r eine l{\"o}sliche Glutamin-Bindungsdom{\"a}ne kodiert, fehlt. In dieser Arbeit wurde der Einfluss zwei dieser Glutamin-ABC-Transporter, mit den Operons glnQPH0411/0412 und glnQPH1098/1099, in S. pneumoniae D39 auf Virulenz und Phagozytose untersucht. Die zwei charakterisierten Transportersysteme bestehen jeweils aus der ATPase GlnQ und einem translatorischem Fusionsprotein aus der Permease GlnP und dem Bindungsprotein GlnH. F{\"u}r die Untersuchungen wurden diese beiden Transporter mittels Insertations-Deletions-Mutagenese inaktiviert. CD-1 M{\"a}use, die intranasal mit biolumineszierenden D39delgln0411/0412 infiziert wurden, zeigten in Echtzeit eine signifikant erh{\"o}hte {\"U}berlebenszeit und eine Attenuierung bei der Auspr{\"a}gung einer Pneumonie im Vergleich zu biolumineszierenden Wildtyp D39 Pneumokokken. Im murinen Sepsismodell mit der D39delgln0411/0412-Mutante zeigte sich eine gem{\"a}{\"s}igte, aber signifikante Abschw{\"a}chung der Pathogenese. Im Gegensatz dazu war die D39delgln1098/1099 Mutante sowohl im murinen Pneumonie- wie auch Sepsismodell massiv attenuiert. Es war eine 100- bis 10000- fach h{\"o}here Infektionsdosis erforderlich, um mit der D39delgln1098/1099-Mutante eine vergleichbare Pathogenese der Pneumonie oder Sepsis wie beim Wildtypstamm D39 hervorzurufen. Im experimentellen Meningitismodell zeigten sich bei der D39delgln1098/1099-Mutante eine erniedrigte Anzahl an Leukozyten im Liquor und ein reduzierter Bakterientiter im Blut im Vergleich zu D39 und D39delgln0411/0412. Auch die Phagozytose-Experimente best{\"a}tigten eine signifikante verminderte {\"U}berlebensrate der beiden gln-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp S. pneumoniae D39, was auf den Einfluss der bakteriellen Fitness auf den Schutz gegen oxidativen Stress hinweist. Diese Ergebnisse demonstrierten, dass beide Glutamin-Aufnahmesysteme f{\"u}r die vollst{\"a}ndige Virulenz der Pneumokokken essentiell sind, aber verschiedene Auswirkungen auf die Pathogenese der Bakterien unter in vivo Bedingungen haben. Das Zelloberfl{\"a}chenprotein PavA der Pneumokokken ist ein Virulenzfaktor, der f{\"u}r invasive Erkrankungen wichtig ist. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass PavA essentiell f{\"u}r die in vivo Besiedlung von Streptococcus pneumoniae D39 in den oberen Atemwegen von M{\"a}usen ist. In dem murinen Pneumoniemodell wurden pavA-Mutanten nicht aus den infizierten Mauslungen eliminiert, sondern persistierten und l{\"o}sten somit eine chronische Infektion aus, w{\"a}hrend Wildtyp-Pneumokokken systemische Erkrankungen verursachten. PavA-defiziente Pneumokokken konnten unter experimentellen Bedingungen nicht aus der Lunge in die Blutbahn streuen. Diese Ergebnisse lie{\"s}en den Schluss zu, dass PavA an der erfolgreichen Kolonisation der Schleimhautoberfl{\"a}chen und an der Translokation der Pneumokokken durch Wirtsbarrieren beteiligt ist.},
  language  = {de}
}