@phdthesis{Kanwal2017,
  author    = {Sajida Kanwal},
  title     = {Delineating the interaction of pneumococcal virulence factors with host eukaryotic cells mediated by matricellular proteins fibronectin and vitronectin},
  journal    = {Abgrenzung der Interaktion von Pneumokokken-Virulenzfaktoren mit Wirts-Eukaryontenzellen, vermittelt durch die matrizellul{\"a}ren Proteine Fibronectin und Vitronectin},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002942-8},
  year      = {2017},
  abstract  = {Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) sind human-spezifische Pathobionten, die einerseits die oberen Atemwege kolonisieren, aber andererseits schwerwiegende lokale und invasive Infektionen beim Menschen verursachen. Pneumokokken exprimieren f{\"u}r die Kolonisierung und Pathogenese ein Repertoire an Kolonisierungs- und Virulenzfaktoren auf der Bakterienoberfl{\"a}che. In dieser Studie wurden die molekularen Wechselwirkungen von zwei wichtigen Virulenzfaktoren, dem „pneumococcal virulence factor A“ (PavA) und „pneumococcal virulence factor B“ (PavB), mit den Matrixproteinen Fibronektin (Fn) und Vitronectin (Vn) untersucht. PavA und PavB sind sogenannte „microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules” (MSCRAMMs), die verschiedene Proteine der extrazellul{\"a}ren Matrix bzw. des Serums binden und f{\"u}r die Pathogenese ausnutzen. PavA und PavB stellen in Bezug auf ihre Struktur und Assoziation mit der Pneumokokkenoberfl{\"a}che zwei verschiedene Proteine dar. PavA ist ein nicht-klassisches Oberfl{\"a}chenprotein (NCSP), dessen Sekretion und Verankerung nicht aufgekl{\"a}rt ist, w{\"a}hrend PavB ein charakteristisches MSCRAMM ist, das {\"u}ber Sortase A kovalent an das Peptidoglykan der Pneumokokken gebunden ist. PavB besteht neben dem Signalpeptid und der C-terminalen Verankerungsdom{\"a}ne aus sich wiederholenden Peptidrepeats, die als „streptococcal surface repeats“ (SSURE) bezeichnet werden. Pneumokokken interagieren bevorzugt mit immobilisiertem humanem Fn. In vitro Infektionen in der Zellkultur zeigen, dass die Anheftung von Pneumokokken an die Wirtszellen in Gegenwart von zellgebundenem Fn erleichtert und unabh{\"a}ngig vom eukaryotischen Wirtszelltyp ist. Diese Interaktion ist keine Spezies-spezifische Interaktion. Durchflusszytometrische und Western-Blot Analysen zeigten, dass Pneumokokken auch die l{\"o}sliche Form des Fibronektinmolek{\"u}ls binden. Dabei war die Bindung dosisabh{\"a}ngig und mit einer Pr{\"a}ferenz f{\"u}r das humane Fn. Die molekularen Wechselwirkungen von PavA und PavB bzw. den SSURE Dom{\"a}nen mit Fn wurde in komplement{\"a}ren Protein-Protein-Interaktionsstudien analysiert. So wurde in Ligand-Overlay-Assays, Oberfl{\"a}chenplasmonresonanzstudien und SPOT-Peptid-Arrays gezeigt, dass PavA und PavB mindestens 13 der 15 Typ-III-Fibronektin-Dom{\"a}nen im C-terminalen Bereich des humanen Fibronektinmolek{\"u}ls erkennen. Interessanterweise binden die beiden Fibronektin-bindenden Proteine (FnBPs) PavA und PavB {\"a}hnliche Peptide in den Fn Typ-III-Repeats. Strukturelle Vergleiche zeigten, dass die Typ-III-Epitope auf den inneren Str{\"a}nge beider β-Bl{\"a}tter, die die Fibronektin-Dom{\"a}nen bilden, lokalisiert werden k{\"o}nnen. Die Spezifit{\"a}t der Interaktion wurde durch die direkte Bindung von synthetischen Peptiden von FnIII1, FnIII5 oder FnIII15 an die FnBPs PavA bzw. PavB nachgewiesen. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Studien ein konserviertes und/oder gemeinsames Muster der molekularen Wechselwirkung der Pneumokokken-FnBPs PavA und PavB mit dem Fibronektinmolek{\"u}l auf. Zus{\"a}tzlich zu Fn interagiert PavB mit anderen Wirtsproteinen wie dem humanem Plasminogen (Plg) und humanem Thrombospondin-1 (hTSP-1). F{\"u}r die S. pneumoniae Proteine PspC und dem PspC-{\"a}hnlichen Hic wurde bereits gezeigt, dass sie mit hTSP-1 sowie menschlichem Vn interagieren k{\"o}nnen. Diese Ergebnisse deuteten eine redundante Funktion der MSCRAMMs an. In dieser Studie wurde die Rolle von PavB als Bindungsprotein f{\"u}r Vitronektin (VnBP) untersucht. Die durchflusszytometrische Analyse best{\"a}tigte PavB als VnBP, da Pneumokokken, die durch Mutagenese kein PavB exprimierten, eine signifikant verminderte F{\"a}higkeit der Vitronektinbindung im Vergleich zu Wildtyp-Pneumokokken zeigten. Bei der Verwendung einer Doppelmutante, die weder PavB noch das VnBP PspC exprimierte, konnte die Bindung von Vitronektin nahezu vollst{\"a}ndig reduziert werden. Die direkten Protein-Protein-Interaktionsstudien wie der Liganden-Overlay, ELISA sowie Oberfl{\"a}chenplasmonresonanzstudien bewiesen die Wechselwirkung von PavB SSURE-Dom{\"a}nen sowohl mit l{\"o}slichem als auch mit immobilisiertem Vn. Die Bindungsaktivit{\"a}t ist jedoch abh{\"a}ngig von der Anzahl der SSURE-Dom{\"a}nen, wobei f{\"u}nf SSURE Dom{\"a}nen die h{\"o}chste Bindungsaktivit{\"a}t gegen{\"u}ber Vn zeigten. Die Wechselwirkung von PavB mit Vitronektin ist ladungsabh{\"a}ngig und kann durch Heparin inhibiert werden. Die Bedeutung der Heparinbindungsdom{\"a}nen von Vitronektin f{\"u}r die PavB-Vn Interaktion wurde ebenfalls {\"u}ber Protein-Protein-Interaktionsstudien analysiert. Die Untersuchungen mit verk{\"u}rzten rekombinanten Vn-Fragmenten zeigten, dass PavB, ebenso wie PspC, die C-terminale Heparin-bindende Dom{\"a}ne (HBD3) von Vitronektin erkennt. Daher deuten diese Ergebnisse auf einen konservierten Mechanismus der Interaktion von Pneumokokken-Proteinen mit Vitronektin hin. Zus{\"a}tzlich zu seiner Funktion als MSCRAMM besitzt PavB die F{\"a}higkeit direkt an Wirts-epithelzellen zu binden. Der zellul{\"a}re Rezeptor f{\"u}r PavB war bislang unbekannt und daher war das Ziel dieser Studie, den/die Zellrezeptor(en) f{\"u}r PavB zu identifizieren. Die Adh{\"a}renzstudien mit Epithelzellen best{\"a}tigten, dass PavB auch in Abwesenheit eines ECM bzw. eines molekularen Br{\"u}ckenmolek{\"u}ls die Anheftung an respiratorische Epithelzellen vermittelt. Die direkte Wechselwirkung zwischen PavB und den Wirtsepithelzellen wurde durch die Verwendung von Cy5-markiertem PavB-Protein in der Durchflusszytometrie analysiert und best{\"a}tigt. Interessanterweise hemmte exogen zugegebenes humanes Vitronektin die Bindung von PavB an die verwendeten Wirtsepithelzellen. Diese Beobachtung f{\"u}hrte zu der Hypothese, dass der wichtigste zellul{\"a}re Rezeptor f{\"u}r Vitronektin, das αvβ3-Integrin, ein potentieller Rezeptor f{\"u}r PavB ist. Diese Hypothese wurde durch funktionelle Inhibitionsstudien mit monoklonalen Antik{\"o}rpern, die spezifische Integrin-Untereinheiten erkennen, unterst{\"u}tzt. Die Ergebnisse zeigten eine reduzierte Bindung von PavB in Gegenwart von blockierenden Antik{\"o}rpern, die das αv-Integrin erkennen. Das PavB das αvβ3-Integrin als Rezeptor auf eukaryotischen Zellen erkennt, wurde des Weiteren {\"u}ber einen direkten Bindungsassay mit embryonalen Fibroblasten aus M{\"a}usen (MEFs) best{\"a}tigt. In den MEFs fehlte das Integrin αvβ3 und eine deutliche Abnahme der Bindung von PavB im Vergleich zu Integrin αvβ3 positiven Zellen konnte nachgewiesen werden. Obwohl die funktionellen inhibitorischen Studien und die Bindungsstudien mit MEFs die Rolle von αvβ3-Integrin als Rezeptor f{\"u}r PavB unterst{\"u}tzten, konnte ein Knockdown des αv-Integrin in Epithelzellen mittels RNA-Interferenz die Bindung von PavB im Vergleich zu den Kontrollzellen nicht signifikant vermindern. Die direkte Interaktion zwischen dem αvβ3-Integrin und PavB von S. pneumoniae wurde mittels Oberfl{\"a}chenplasmonresonanzanalysen bewiesen. Damit zeigt diese Studie zum ersten Mal die direkte Wechselwirkung eines Gram-positiven extrazellul{\"a}ren Pathogens, n{\"a}mlich Streptococcus pneumoniae, mit einem der Wirts-ICAMs, dem αvβ3-Integrin. Zusammenfassend wurden in der vorliegenden Studie wichtige Aspekte der molekularen Wechselwirkung von Pneumokokken MSCRAMMs PavA und PavB mit den humanen Proteinen Fibronektin bzw. Vitronektin analysiert. Die Interaktion von PavA und PavB konnte auf die C-terminalen FnIII-Repeats eingegrenzt werden und die HBD3 des Vitronektinmolek{\"u}ls wurde als wichtige Bindungsdom{\"a}ne f{\"u}r die Interaktion mit PavB identifiziert. Dar{\"u}ber hinaus konnte in dieser Studie der zellul{\"a}re Rezeptor αvβ3-Integrin f{\"u}r das S. pneumoniae Adh{\"a}sin PavB identifiziert werden. Der molekulare Mechanismus und die biologische Bedeutung der PavB- αvβ3-Integrin Interaktion f{\"u}r die zellul{\"a}re Wirtsantwort muss in zuk{\"u}nftigen Studien aufgekl{\"a}rt werden.},
  language  = {en}
}