@phdthesis{Kasprzak2017,
  author    = {Jakub Kasprzak},
  title     = {Alcohol dehydrogenases as biocatalysts for the production of enantiomerically pure chiral alcohols},
  journal    = {Alkoholdehydrogenasen als Biokatalysatoren zur Herstellung von enantiomerenreinen chiralen Alkoholen},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002689-2},
  year      = {2017},
  abstract  = {Enantiomerenreine chirale Alkohole sind Schl{\"u}sselverbindungen bei der Herstellung von Chemikalien, einschlie{\"s}lich Pharmazeutika. Chemische Synthesen erm{\"o}glichen f{\"u}r ein Enantiomer eine maximale Ausbeute von 50\% (>50\% Ausbeute ist mit chiralen Katalysatoren erreichbar, die in der chemischen Synthese verwendet werden), w{\"a}hrend die enzymatisch katalysierte Synthese zu ann{\"a}hernd 100\% Ausbeute f{\"u}hrt. Hierdurch kann eine teure und zeitaufwendige Racemat-Trennung vermieden werden. Alkoholdehydrogenasen (ADHs) sind aufgrund ihrer hohen Aktivit{\"a}t und Stereoselektivit{\"a}t h{\"a}ufig verwendete Enzyme zur Synthese von chiralen Alkoholen durch Reduktion der entsprechenden Aldehyde oder Ketone unter Verbrauch von NADH als Co-Faktor. Die Abh{\"a}ngigkeit vom Co-Faktor erfordert ein geeignetes Regenerationssytem um die Gesamtkosten f{\"u}r den Prozess zu minimieren. In dieser Arbeit wurden verschiedene Regenerationsverfahren genutzt, verglichen und bez{\"u}glich ihres Potentials bewertet. Zwei bakterielle Alkoholdehydrogenasen von R. erythropolis und C. hydrogenoformans wurden auf Grund ihrer, bereits in der Literatur beschriebenen, ausgezeichneten Eigenschaften bez{\"u}glich der Synthese von chiralen Alkoholen ausgew{\"a}hlt und anschlie{\"s}end in zwei verschiedenen Hefen, A. adeninivorans und H. polymorpha, synthetisiert. Hierf{\"u}r wurden Codon optimierte Varianten der Gene ReADH und ChADH durch chemische Synthese erzeugt, mit einer His-Tag codierenden Sequenz am 5‘ bzw. 3‘ Ende ausgestattet und in die Expressionsvektoren Xplor2 mit TEF1 Promotor und PHO5-Terminator, sowie pFPMT mit FMD-Promotor und MOX-Terminator kloniert. Nach erfolgter Transformation von A. adeninivorans (Xplor2) bzw. H. polymorpha (pFPMT) wurden die besten Transformanden ausgew{\"a}hlt und f{\"u}r weitere Untersuchungen verwendet. Die Synthese von ReADH-6H wurde sowohl in A. adeninivorans als auch in H. polymorpha untersucht und verglichen. Die jeweils akkumulierten rekombinanten ReADH-6Hs (A-ReADH-6H und H-ReADH-6H) wurden mittels IMAC gereinigt und vollst{\"a}ndig biochemisch charakterisiert. Dabei zeigten sich einige Unterschiede in ihren pH- und Temperaturoptima, Thermostabilit{\"a}t und ihrer Aktivit{\"a}t. A-ReADH (A. adeninivorans) und H-ReADH (H. polymorpha) waren hoch aktiv f{\"u}r die Reduktion von Acetophenon, 4-Hydroxy-3-butanon und 4-Chloracetessigs{\"a}ureethylester als auch f{\"u}r die Oxidationsreaktion von 1-Phenylethanol und 1,6-Hexandiol. A-ReADH-6H und H-ReADH-6H wurden f{\"u}r die Synthese von 1- (S) -Phenylethanol und Ethyl-(R)-4-chlor-3-hydroxybutanoat genutzt, wobei ein substratgekoppeltes Co-Faktorregenerationssystem verwendet wurde. Es konnte eine >99\%ige Enantiomerenreinheit der Produkte erreicht werden. Weiterhin wurde A. adeninivorans als Ganzzellkatalysator f{\"u}r die Synthese der beiden chiralen Alkohole verwendet. Dabei wurde BmGDH (Bacillus megaterium Glucosedehydrogenase) mit ReADH-6H co-exprimiert, um den Co-Faktor NADH zu regenerieren. Ein Vergleich zwischen den isolierten Enzymen und den permeabilisierten Ganzzellkatalysatoren zeigte, dass letztere mit 92\% umgesetzten Acetophenon in 60 min, besser f{\"u}r die Herstellung von 1-(S)-Phenylethanol geeignet sind. Dies konnte jedoch nicht f{\"u}r die der Synthese von Ethyl-(R)-4-chlor-3-hydroxybutanoat best{\"a}tigt werden. Obwohl die Geschwindigkeit der Synthese von Ethyl- (R)-4-chlor-3-hydroxybutanoat durch Ganzzellkatalysatoren leicht erh{\"o}ht wurde (80\% Substratumwandlung in 120 min), konnte keine signifikante Verbesserung gegen{\"u}ber dem Einsatz von freien Enzymen beobachtet werden. Des Weiteren wurde die C. hydrogenoformans Alkoholdehydrogenase in A. adeninivorans exprimiert und biochemisch charakterisiert. Das Enzym zeigte jedoch nur f{\"u}r das Substrat Ethylbenzoylformiat eine hohe Aktivit{\"a}t. ChADH und BmGDH (Bacillus megaterium Glucosedehydrogenase) co-exprimierende A. adeninivorans und H. polymorpha Zellkatalysatoren wurden generiert und f{\"u}r die Synthese von Ethyl- (R)-mandelat (Reduktionsprodukt von Ethylbenzoylformiat) eingesetzt. Die Enantiomerenreinheit des Reaktionsproduktes betrug dabei > 98\%. H. polymorpha Katalysatoren zeigten f{\"u}r die Synthese eine h{\"o}here Effizienz als A. adeninivorans Zellen. Die erstgenannten waren in der Lage 93\% vom Ethylbenzoylformiat innerhalb von 180 min zu konvertieren, w{\"a}hrend letztere 94\% des Substrates innerhalb von 360 min umwandelten. Durch Einschlussimmobilisierung der Biokatalysatoren in Lentikats® wurde eine Verbesserung der Stabilit{\"a}t und damit eine erh{\"o}hte Wiederverwendungsh{\"a}ufigkeit erreicht. Die erreichten Raumzeitausbeuten betrugen 3.07 mmol l-1h-1 und 6.07 mmol l-1h-1 mit A. adeninivorans bzw. H. polymorpha als Ganzzellkatalysatoren. Abschlie{\"s}end wurde eine Alkoholdehydrogenase von A. adeninivorans charakterisiert. Basierend auf der Homologie mit der Alkohol-Dehydrogenase 1 von S. cerevisiae wurde dazu das AADH1 Gen ausgew{\"a}hlt, isoliert und in A. adeninivorans {\"u}berexprimiert.},
  language  = {en}
}