@phdthesis{Leipold2013,
  author    = {Friedemann Leipold},
  title     = {Untersuchungen zu rekombinanten eukaryotischen Baeyer-Villiger-Monooxygenasen},
  journal    = {Investigation of recombinant eukaryotic Baeyer-Villiger monooxygenases},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001438-4},
  year      = {2013},
  abstract  = {Im Rahmen dieser Dissertation wurden Gene von Baeyer-Villiger-Monooxygenasen (BVMOs) aus Cylindrocarpon radicicola ATCC 11011 identifiziert und die Enzyme im Vergleich mit prokaryotischen BVMOs charakterisiert. Ziel dabei war es, das enzymatische Potenzial dieses filament{\"o}sen Pilzes bez{\"u}glich der biokatalytischen Baeyer-Villiger-Oxidation zu evaluieren. Da das Genom von C. radicicola nicht sequenziert war, wurden zur Auffindung neuer BVMO-Sequenzen Methoden der Proteinaufreinigung sowie eine Identifizierung {\"u}ber molekularbiologische Ans{\"a}tze angestrebt. Die BVMO konnte jedoch nicht {\"u}ber eine Aufreinigung aus dem Zellextrakt von C. radicicola, unter Anwendung eines dreistufigen Reinigungsprotokolls, in der f{\"u}r nachgelagerte Untersuchungen erforderlichen Reinheit gewonnen werden. Aus diesem Grund erfolgte die Identifizierung von BVMO-Sequenzen mit Hilfe molekularbiologischer Methoden. Mit degenerierten Primern, welche konservierte Sequenzbereiche bekannter BVMOs enthielten und {\"u}ber die CODEHOP-Strategie abgeleitet wurden, konnten drei zu BVMOs homologe Sequenzfragmente amplifiziert und identifiziert werden. Zwei der Sequenzen waren homolog zu putativen pilzlichen Steroidmonooxygenasen (STMOs). Durch Sequenzvergleiche konnte gezeigt werden, dass diese Sequenzen vermutlich kryptische Gene darstellen. Aus diesem Grund erfolgten keine weiteren Untersuchungen zu diesen zwei Sequenzen. Es gelang jedoch, eine der aus C. radicicola neu identifizierten Sequenzen funktionell in E. coli {\"u}berzuexprimieren, wobei diese in weiteren Untersuchungen als Cycloalkanonmonooxygenase (CAMO) identifiziert werden konnte. Die Prim{\"a}rstruktur dieser BVMO besteht aus 531 Aminos{\"a}ureresten, welche ca. 45\% Sequenzidentit{\"a}t zu bekannten Cyclohexanonmonooxygenasen (CHMOs) aufweisen. Die Expression des mit aminoterminalem Hexahistidintag fusionierten Proteins wurde erfolgreich auf einen 20-Liter-Ma{\"s}stab vergr{\"o}{\"s}ert und die CAMO nachfolgend aufgereinigt. Die CAMO weist ein breites Substratspektrum auf, wobei ein Umsatz vieler cycloaliphatischer und bicycloaliphatischer Ketone ermittelt werden konnte. Dabei ist die hohe katalytische Effizienz gegen{\"u}ber Cyclobutanon als eine besondere Eigenschaft dieser BVMO hervorzuheben. F{\"u}r die CAMO konnte kein Umsatz von Steroiden ermittelt werden. Neben der Oxygenierung von Cycloalkanonen konnte f{\"u}r das Enzym eine Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber offenkettigen Ketonen wie Cyclobutyl-, Cyclopentyl- und Cyclohexylmethylketon nachgewiesen werden. Die neu beschriebene eukaryotische BVMO katalysiert folglich Reaktionen, die bisher f{\"u}r viele prokaryotische BVMOs - so insbesondere CHMOs - nicht beschrieben wurden. Die nachgewiesene F{\"a}higkeit von C. radicicola, mit Cyclohexanon als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle zu wachsen, deutet auf eine katabole Funktion der Umsetzung von Cycloalkanonen hin. Diese Eigenschaft ist f{\"u}r Sanierungsverfahren mineral{\"o}lbelasteter Umweltkompartimente von Bedeutung und war bisher nur f{\"u}r wenige Pilze bekannt. Da bisher keine BVMOs aus eukaryotischen Organismen rekombinant hergestellt wurden, stellt die im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich durchgef{\"u}hrte rekombinante Expression der CAMO aus C. radicicola das erste Beispiel f{\"u}r ein derartiges Enzym dar. F{\"u}r einen Gro{\"s}teil der f{\"u}r C. radicicola beschriebenen biokatalytischen F{\"a}higkeiten ist eine Steroidmonooxygenase (STMO) von besonderer Bedeutung. Daher wurde zu Vergleichszwecken das Substratspektrum einer STMO aus Rhodococcus rhodochrous DSM 43269 analysiert. Hierbei konnte erstmals gezeigt werden, dass dieses Enzym neben Steroiden auch weitere offenkettige Ketone wie Cyclopentyl- und Cyclohexylmethylketon umsetzt. Besonders interessant war dabei die nachgewiesene STMO-katalysierte Oxygenierung von Cyclobutanonderivaten, da das Enzym mit Ausnahme dieser Substratgruppe nur lineare Ketone umsetzt. Da sowohl f{\"u}r die CAMO aus C. radicicola als auch f{\"u}r die STMO aus R. rhodochrous ein Umsatz von Cyclobutanonderivaten nachgewiesen werden konnte, wurde deren Enantioselektivit{\"a}t in Biokatalysen mit dem Substrat 3-Phenylcyclobutanon untersucht und mit der CHMO aus Acinetobacter calcoaceticus verglichen. Die CAMO zeigte dabei eine h{\"o}here Enantioselektivit{\"a}t als die CHMO. Dagegen ist die STMO enantiodivergent zur CHMO und weist eine h{\"o}here Enantioselektivit{\"a}t als bisher bekannte (S)-selektive BVMOs auf. Die untersuchten BVMOs bieten somit ein hohes Potenzial im Bereich der Herstellung chiraler Butyrolactonderivate, welche wertvolle Bausteine f{\"u}r die Naturstoffsynthese darstellen. Ein weiterer Aspekt lag in der Erweiterung des Substratspektrums der STMO aus R. rhodochrous {\"u}ber rationales Protein-Design, um so ein tieferes Verst{\"a}ndnis der Sequenz-Aktivit{\"a}ts-Beziehungen zu gewinnen. Basierend auf Ergebnissen der Literatur bez{\"u}glich Mutanten der zu dieser STMO homologen Phenylacetonmonooxygenase aus Thermobifida fusca wurden Varianten der STMO aus R. rhodochrous erzeugt. F{\"u}r diese konnte jedoch kein erweitertes Substratspektrum ermittelt werden.},
  language  = {de}
}