@phdthesis{Passvogel2015, author = {Katharina Pa{\"s}vogel}, title = {Generierung und Evaluierung rekombinanter Pseudorabies Virus basierter Vektor-Vakzine zur Immunisierung von Schweinen gegen das pandemische H1N1 Influenzavirus von 2009}, journal = {Generation and evaluation of recombinant pseudorabies virus based vector vaccines for the immunization of pigs against pandemic H1N1 influenza virus of 2009}, url = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002358-2}, year = {2015}, abstract = {Influenzaviren z{\"a}hlen zu den gef{\"a}hrlichsten Infektionserregern, die im Menschen weltweit schwere respiratorische Erkrankungen ausl{\"o}sen. Von gro{\"s}er Relevanz sind allerdings auch Reservoirwirte, in denen die Infektionen h{\"a}ufig mild verlaufen, aber durch Mutationen und Reassortierung einzelner Genomsegmente neue, potentiell auch humanpathogene Influenzaviren entstehen k{\"o}nnen. Die im Jahre 2009 aufgetretene humane Influenzapandemie, welche durch ein H1N1 „swine origin“ Influenza A Virus (SoIV) ausgel{\"o}st wurde, verdeutlichte die besondere Bedeutung porziner Reservoirwirte. Da Schweine sowohl f{\"u}r avi{\"a}re als auch humane Influenza A Viren empf{\"a}nglich sind, wird ihnen eine wichtige Rolle als „mixing vessel“ f{\"u}r die Entstehung neuer Influenzaviren zugeschrieben. Aufgrund vielversprechender Entwicklungen auf dem Gebiet der Lebendvirus-Vektor-Vakzine war es das Ziel dieser Arbeit, einen neuartigen Vektor-Impfstoff f{\"u}r Schweine gegen das pandemische H1N1 SoIV auf der Basis eines attenuierten porzinen Virus zu generieren. Da das Pseudorabies Virus (PrV) nicht humanpathogen ist und in seinem nat{\"u}rlichen Wirt, dem Schwein, hervorragend repliziert, eignete es sich besonders f{\"u}r die Entwicklung eines rekombinanten Vektor-Impfstoffs. Hierzu wurde der bew{\"a}hrte Impfstamm PrV-Bartha genetisch so ver{\"a}ndert, dass anstelle des nicht essentiellen herpesviralen Glycoproteins gG immunogene Influenzavirusproteine wie die H{\"u}ll-Glykoproteine H{\"a}magglutinin (HA) und Neuraminidase (NA), aber auch das Nukleoprotein (NP) und die Matrixproteine (M1 und M2) des pandemischen H1N1 SoIV exprimiert werden. Die Expression erfolgte unter der Kontrolle des humanen oder murinen Cytomegalievirus immediate-early Promotors, wobei sich letzterer als st{\"a}rker erwies. Durch Insertion eines synthetischen Introns in der 5´-nicht-translatierten Region konnte die Expression der Transgene weiter gesteigert werden. Zu einer substantiellen Verbesserung der Expression f{\"u}hrte die Insertion synthetischer HA- (synH1) und NA-Gene (synN1), deren Sequenzen an die Codon-Pr{\"a}ferenzen von PrV angepasst waren. In tierexperimentellen Studien wurde gezeigt, dass sowohl die optimierte HA- (PrV-BaMI-synHI), als auch die optimierte NA-exprimirende PrV-Rekombinante (PrV-BaMI-synN1) nach intramuskul{\"a}rer prime-boost Vakzinierung sieben Wochen alter Saugferkel deutlich h{\"o}here Antigen-spezifische Antik{\"o}rpertiter induzierte als eine intranasale Infektion mit H1N1 SoIV. Auch die ein- bzw. zweimalige intranasale Impfung mit PrV-BaMI-synH1 f{\"u}hrte in allen Tieren zur Bildung HA-spezifischer Serumantik{\"o}rper, allerdings in deutlich geringen Mengen. In allen F{\"a}llen f{\"u}hrte die 3 Wochen nach Erstimmunisierung durchgef{\"u}hrte Auffrischungsimpfung zu einem betr{\"a}chtlichen Anstieg der HA- bzw. NA-spezifischen Antik{\"o}rpertiter. In durchflusszytometrischen Analysen peripherer Blutlymphozyten konnte ebenfalls eine vermehrte Aktivierung und Proliferation von B-Zellen zu Antik{\"o}rper-produzierenden Plasmazellen nach der Auffrischungsimpfung beobachtet werden. Au{\"s}erdem wurde festgestellt, dass die durch PrV-BaMI-synN1 induzierte NA-spezifische Immunantwort deutlich sp{\"a}ter einsetzte als die durch PrV-BaMI-synH1 vermittelte HA-spezifische Reaktion. Versuchstiere, die gleichzeitig mit PrV-BaMI-synH1 und PrV-BaMI-synN1 geimpft wurden, entwickelten sowohl HA- als auch NA-spezifische Antik{\"o}rper zu vergleichbaren Titern wie mit den einzelnen Viren immunisierte Tiere. Drei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden alle mit PrV-BaMI-synH1 und/oder PrV-BaMI-synN1 geimpften Schweine sowie mit dem leeren Vektor PrV-Bartha vakzinierte und naive Kontrolltiere einer Belastungsinfektion mit dem pandemischen H1N1 SoIV A/California/7/09 unterzogen. Beide potentiellen Vektor-Impfstoffe verhinderten die Ausbildung klinische Symptome und hemmten die Replikation und Ausscheidung des Belastungsvirus signifikant, wie real-time RT-PCR Analysen von Nasentupferproben zeigten. Allerdings war die durch intramuskul{\"a}re prime-boost Vakzinierung mit PrV-BaMI-synN1 bewirkte Reduktion der Viruslast deutlich geringer als die mit PrV-BaMI-synH1. Die kombinierte intramuskul{\"a}re Applikation beider Vektor-Vakzine zeigte keine additiven Effekte, sondern eine {\"a}hnliche Schutzwirkung wie PrV-BaMI-synH1 allein. W{\"a}hrend die zweimalige intramuskul{\"a}re Immunisierung mit PrV-BaMI-synH1 oder beiden Viren die {\"U}bertragung des Belastungsvirus auf naive Kontakttiere zwar erheblich verz{\"o}gerte, aber nicht verhinderte, wurde dieses Ziel durch eine zweimalige intranasale Immunisierung mit PrV-BaMI-synH1 erreicht. Die RNA-Analysen der Tupferproben zeigten dabei eine fast vollst{\"a}ndige Inhibition der Belastungsvirusreplikation, obwohl die HA-spezifischen Antik{\"o}rper in diesen Tieren weitaus geringer waren als in intramuskul{\"a}r geimpften Versuchstieren. Auch im Vergleich zu einer einmaligen intranasalen Vakzinierung reduzierte die intranasale Auffrischungsimpfung mit PrV-BaMI-synH1 die Replikationsdauer und die nachweisbaren Mengen des H1N1 SoIV erheblich.}, language = {de} }