@phdthesis{Busch2019,
  author    = {Diana Busch},
  title     = {Charakterisierung der Expression und Funktion metabolischer Enzyme im humanen intestinalen Gewebe},
  journal    = {Characterization of expression and function of metabolic enzymes in human intestinal tissue},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-34423},
  pages     = {74},
  year      = {2019},
  abstract  = {Bei der Arzneimittelentwicklung liegt der Fokus nicht nur auf der Wirksamkeit und Sicherheit einer pharmakologisch aktiven Substanz, sondern auch auf einer m{\"o}glichst einfachen, idealerweise oralen Applikation. Um die ben{\"o}tigten Wirkstoffkonzentrationen im Zielorgan zu erreichen, wird die einzunehmende Dosis eines Medikaments in Abh{\"a}ngigkeit der pr{\"a}systemischen Elimination ermittelt. Inzwischen ist bekannt, dass nicht ausschlie{\"s}lich der hepatische, sondern auch der intestinale Stoffwechsel die orale Bioverf{\"u}gbarkeit eines Medikaments wesentlich beeinflussen kann. Arzneistoffe, die w{\"a}hrend der Darmpassage einer starken Metabolisierung unterliegen, sind zudem pr{\"a}destiniert f{\"u}r unerw{\"u}nschte Interaktionen mit anderen Substanzen, welche die entsprechenden Stoffwechselenzyme hemmen oder induzieren. F{\"u}r die Absch{\"a}tzung pharmakokinetischer Parameter eines neuen Wirkstoffs sind daher Kenntnisse zur Expression sowie Funktion klinisch relevanter intestinaler Stoffwechselenzyme von Bedeutung. Bisher publizierte Daten basieren gr{\"o}{\"s}tenteils auf der Genexpression, obwohl aufgrund posttranskriptionaler Prozesse nicht zwingend Aussagen zur resultierenden Proteinmenge getroffen werden k{\"o}nnen. Die verf{\"u}gbaren Daten zum intestinalen Proteingehalt wurden mittels immunologischer Methoden erhoben, die erhebliche Limitationen in Bezug auf Spezifit{\"a}t, Reproduzierbarkeit und Robustheit aufweisen. Diese Aspekte finden bei den inzwischen etablierten LC-MS/MS-basierten Targeted-Proteomics-Methoden Ber{\"u}cksichtigung. Dazu werden die Proteine einer Messprobe enzymatisch gespalten, um entstehende proteospezifische Peptide zur Quantifizierung der Proteine von Interesse zu nutzen. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Entwicklung und Validierung einer entsprechenden Methode zur gleichzeitigen Bestimmung von CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A5, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7 sowie UGT2B15 in biologischen Matrices, welche die aktuell g{\"u}ltigen Leitlinien in Bezug auf Selektivit{\"a}t, Linearit{\"a}t, Richtigkeit, Pr{\"a}zision und Stabilit{\"a}t erf{\"u}llt. Bereits bei der ersten Anwendung der Methode zur Quantifizierung der Enzyme in kommerziell erh{\"a}ltlichen und selbst isolierten Mikrosomen zeigte sich, welchen erheblichen Einfluss die Probenvorbereitung auf die ermittelten Proteingehalte hat. Diese Erkenntnis wurde im Rahmen eines internationalen Projektes best{\"a}tigt, bei dem humane Leberproben desselben Ursprungs in diversen Laboren mit den dort etablierten Methoden prozessiert worden sind. Bezogen auf die eingesetzte Gewebemenge ergaben sich bei der Messung der Mikrosomen 6 - 30-fach geringere Enzymgehalte als bei der Analyse des nicht-fraktionierten Gewebes, da die subzellul{\"a}re Aufspaltung einer Probe mit erheblichen Proteinverlusten einhergeht. Folglich wurden alle weiteren Untersuchungen zur absoluten Enzymquantifizierung unter Verwendung von filterbasierten Zentrifugaleinheiten (filter aided sample preparation; FASP) mit Gesamtgewebelysatproben durchgef{\"u}hrt. Sowohl die optimierte Probenaufarbeitung als auch die validierte Targeted-Proteomics-Methode fanden bei der Untersuchung der Darmsegmente von 9 Spendern Anwendung, wobei jeweils Gewebe aus dem Duodenum, oberen und unteren Jejunum, Ileum sowie Colon zur Verf{\"u}gung stand. Von den 13 untersuchten Enzymen wurden in allen D{\"u}nndarmabschnitten nur CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4, CYP3A5, UGT1A1, UGT1A3 und UGT2B7 nachgewiesen, deren Gehalt im Jejunum am h{\"o}chsten war. Im Colon wurde auf Proteinebene keines der Metabolisierungsenzyme detektiert. Die entsprechenden Genexpressionsdaten dieser 8 Enzyme korrelieren signifikant mit den ermittelten Proteinwerten. Korrespondierend zur fehlenden Nachweisbarkeit der {\"u}brigen 5 Enzyme auf Proteinebene waren die Gene CYP2B6, CYP2C8, CYP2E1 sowie UGT2B15 nur sehr geringf{\"u}gig und CYP1A2 gar nicht exprimiert. Zur Charakterisierung der metabolischen Aktivit{\"a}t der intestinalen Enzyme wurde eine weitere LC-MS/MS-basierte Methode entwickelt und validiert. Als Modellsubstrate fungierten Diclofenac (CYP2C9), Omeprazol (CYP2C19), Dextromethorphan (CYP2D6), Midazolam (CYP3A), Ezetimib (UGT1A) und Naloxon (UGT2B7). Die begrenzte Verf{\"u}gbarkeit des intestinalen Gewebes sowie dessen sehr geringer mikrosomaler Proteingehalt stellten besondere Anforderungen an die Sensitivit{\"a}t der Methode. Ihre Eignung zur Charakterisierung der intestinalen Metabolisierungsaktivit{\"a}t wurde bei der Anwendung auf ein jejunales Mikrosomen-Gemisch gezeigt. Die im Rahmen dieser Arbeit generierten Daten zur Expression klinisch bedeutsamer Metabolisierungsenzyme entlang des humanen Darms tragen zu einem besseren Verst{\"a}ndnis des intestinalen First-Pass-Metabolismus bei. Diese Kenntnisse k{\"o}nnen sowohl bei der Entwicklung neuer Arzneistoffe als auch f{\"u}r die Erstellung von Physiologie-basierten pharmakokinetischen Modellen (PBPK-Modellen) n{\"u}tzlich sein, um die orale Bioverf{\"u}gbarkeit sowie das Interaktionspotential pharmakologisch aktiver Substanzen abzusch{\"a}tzen.},
  language  = {de}
}