@phdthesis{Scholz2009,
  author    = {Anja Scholz},
  title     = {Expression bakterieller Gene zur PHA-Synthese in Arxula adeninivorans und Untersuchungen zum Stoffwechsel der Hefe},
  journal    = {Expression of bacterial genes for the PHA synthesis in the yeast Arxula adeninivorans},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000663-9},
  year      = {2009},
  abstract  = {Kunststoff{\"a}hnliche Polymere wie Polyhydroxyalkanoate (PHA) fanden in den letzten Jahren immer gr{\"o}{\"s}ere Ber{\"u}cksichtigung zur Substitution von Kunststoffen. Die attraktivsten Vertreter dieser Biopolymere sind dabei das Poly-3-hydroxybutyrat (PHB),das Poly-3-hydroxyvalerat (PHV) und das Poly-3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyvalerat(PHBV). F{\"u}r eine kosteng{\"u}nstige Herstellung von PHA sind allerdings biotechnologisch etablierte Erzeuger notwendig. F{\"u}r eine umweltfreundliche Produktion bieten sich Hefen an. Viele Hefen sind im Gegensatz zu den PHA-synthetisierenden Prokaryoten weder virulent noch pathogen. Allerdings verf{\"u}gen sie nicht {\"u}ber die notwendige genetische Ausstattung zur PHA-Synthese. In der vorliegenden Arbeit wurden die Gene der PHB- bzw. PHBV-Synthese aus Cupriavidus necator und Methylobacterium extorquens in das Hefegenom von Arxula adeninivorans integriert. Es wurden die Gene phbA (kodiert f{\"u}r eine {\"s}-Ketothiolase), phbB (kodiert f{\"u}r eine Acetoacetyl-CoA-Reduktase) und phbC aus C. necator sowie phaC aus M. extorquens genutzt, wobei die beiden letzteren f{\"u}r PHA-Synthasen kodieren. F{\"u}r die Integration dieser PHA-Gene wurden sog. YIEC (Yeast Integration Expression Cassettes) konstruiert, mit welchen die Gene in die 25S-rDNA von A. adeninivorans integriert werden konnten. Es wurden jeweils die PHA-Synthasegene phaC oder phbC mit phbA und phbB aus Cupriavidus necator integriert. Dadurch entstanden die sog. 3-fach-Transformanten (3-fach/phaC und 3-fach/phbC). Ebenso wurden die PHA-Synthasegene einzeln integriert, wodurch die sog. 1-fach-Transformanten (1-fach/phaC und 1-fach/phbC) entstanden. Im Mittelpunkt der durchgef{\"u}hrten Arbeiten standen die Bestimmungen der Enzymaktivit{\"a}ten der rekombinanten PHA-Synthasen, die Determinierung von PHA sowie die Untersuchungen der Ver{\"a}nderungen der Stoffwechselintermediate durch die Integration der PHA-Gene. Bevor die vier PHA-Transformanten generiert worden waren, waren in einer Machbarkeitsstudie die PHA-Gene phbA und phbB integriert und die Expression der rekombinanten Enzyme mit Enzymaktivit{\"a}tsassays nachgewiesen worden. In den vier verwendeten PHA-Transformanten (1-fach/phaC, 1-fach/phbC sowie 3-fach/phaC und 3-fach/phbC) wurden phbAp und phbBp mittels spezifischer Antik{\"o}rper nachgewiesen. Die Expression der PHA-Synthasegene wurde in den PHA-Transformanten durch Enzymaktivit{\"a}tsassays vorgenommen. Die PHA-Transformanten wurden mit Glukose, Acetat, Ethanol, Propion- und Butters{\"a}ure alleinig und im Shift von Glukose auf eine andere Kohlenstoffquelle kultiviert. Dabei wurde festgestellt, dass Ethanol generell von den PHA-Transformanten nicht verwertet werden kann. Parallel zu den Analysen des Wachstumsverhaltens wurden die Enzymaktivit{\"a}tsassays durchgef{\"u}hrt. Dabei konnten neben der Glukosekultivierung erstmals auch bei Acetatkultivierung Aktivit{\"a}ten der rekombinanten PHA-Synthasen nachgewiesen werden. Sowohl bei der Glukose- als auch der Acetatkultivierung zeigten die vier PHA-Transformanten verschiedene Verl{\"a}ufe der Aktivit{\"a}ten. F{\"u}r die Transformante, in welche das PHA-Synthasegen phaC aus Methylobacterium extorquens integriert worden war (1-fach/phaC), wurden sowohl f{\"u}r die Glukose- als auch die Acetatkultivierung die Aktivit{\"a}tswerte f{\"u}r die PHA-Synthasen bestimmt. F{\"u}r die Transformante, welche das PHA-Synthasegen phbC aus Cupriavidus necator tr{\"a}gt (1-fach/phbC), konnten nur bei Glukosekultivierung PHA-Synthaseaktivit{\"a}ten bestimmt werden. Diese wurden w{\"a}hrend der Kultivierung geringer. F{\"u}r die 3-fach-Transformante 3-fach/phaC konnten PHA-Synthaseaktivit{\"a}ten sowohl f{\"u}r die Glukose- als auch die Acetatkultivierung bestimmt werden, die w{\"a}hrend der beiden Kultivierungen geringer wurden. F{\"u}r die Transformante, welche alle drei PHA-Gene inklusive des PHA-Synthasegens phbC (3-fach/phbC) tr{\"a}gt, wurden w{\"a}hrend der Glukosekultivierung gleich bleibende und w{\"a}hrend der Kultivierung mit Acetat stark steigende PHA-Synthaseaktivit{\"a}ten ermittelt. Mit einer F{\"a}rbemethode sollte in den 1-fach-Transformanten PHB nachgewiesen werden. Dazu wurden die Farbstoffe BODIPY 493/503 und Nilrot, die speziell intrazellul{\"a}res PHB bzw. Neutrallipide f{\"a}rben, verwendet. Es konnte mit BODIPY 493/503 kein intrazellul{\"a}r eingelagertes PHB detektiert werden. Daher handelt es sich bei den Einlagerungen um Lipide. F{\"u}r eine genauere Analyse der die durch die Integration der PHA-Gene entstehenden Stoffwechselprodukte wurde eine GC/MS-Methode entwickelt. In ersten Messungen zeigte sich f{\"u}r die PHA-Transformanten ein Peak, der die gleiche Retentionszeit wie 3-Hydroxyvalerat (3HV), das Monomer von PHV hatte. Dieser Peak wurde auch im Kontrollstamm G1212k detektiert. Da Cupriavidus necator mit der Kohlenstoffquelle L{\"a}vulins{\"a}ure (L{\"a}S) das PHA Poly-4-hydroxyvalerat produziert, wurde L{\"a}vulins{\"a}ure in der gaschromatographischen Methode als Referenzsubstanz eingesetzt. Dabei zeigte sich, dass L{\"a}S die gleiche Retentionszeit hat wie 3HV. Anschlie{\"s}end wurden die Massenspektren von 3-Hydroxybutyrat (3HB), dem Monomer von PHB, sowie 3HV und L{\"a}S verglichen. Dabei erwies sich, dass der Peak gleicher Retentionszeit nicht f{\"u}r 3HB oder 3HV steht, sondern f{\"u}r L{\"a}S. Es konnten somit in keiner der PHA-Transformanten 3HB oder 3HV nachgewiesen werden. Anhand der GC/MS-Daten wurde allerdings ersichtlich, dass die Integration aller drei PHA-Gene den Stoffwechsel der Hefe A. adeninivorans st{\"a}rker beeinflusst als die alleinige Integration der PHA-Synthasegene. Daher wurden Citrat, Succinat, Malat und Fumarat (als Summenparameter f{\"u}r Maleins{\"a}ure und Fumars{\"a}ure) sowie die Fetts{\"a}uren Palmitin-, Stearin- und Linolens{\"a}ure als weitere Referenzsubstanzen eingesetzt. Es zeigten sich je nach Wahl der Kohlenstoffquelle und der Kultivierungsbedingungen Unterschiede zwischen 3-fach-Transformanten und Kontrollstamm G1212k. In der Glukosekultivierung als auch der Co-Kultivierung von Glukose und Acetat (1:2) konnten die meisten Unterschiede zwischen PHA-Transformanten und G1212k festgestellt werden. Es wurden z. B. f{\"u}r die Glukosekultivierung in den 3-fach-Transformanten h{\"o}here Gehalte an Fetts{\"a}uren detektiert. Daraus l{\"a}sst sich eine unterst{\"u}tzende Wirkung der rekombinanten Proteine der PHA-Synthese zur Fetts{\"a}urebiosynthese ableiten. Bei der Acetatkultivierung wird neben der PHA-Synthese und der Fetts{\"a}urebiosynthese das zentrale Zellintermediat Acetyl-CoA auch im Glyoxylatweg genutzt. Der Glyoxylatweg findet zwar in den Peroxisomen und nicht wie PHA- und Fetts{\"a}uresynthese im Zytosol statt, wird aber in Abh{\"a}ngigkeit von der Kohlenstoffquelle und durch die Aktivit{\"a}ten des Zitronens{\"a}urezyklus geregelt. Die h{\"o}heren Gehalte an Citrat bei der Co-Kultivierung von Glukose und Acetat (1:2) geben daher einen Anhaltspunkt zur Nutzung des Glyoxylatweges. Aufgrund der erh{\"o}hten Fetts{\"a}uregehalte w{\"a}hrend der Glukosekultivierungen und der Nutzung des Glyoxylatweges bei Kultivierung mit Acetat wird ersichtlich, dass die Integration aller drei PHA-Gene dazu f{\"u}hrt, dass vermehrt Acetyl-CoA genutzt und Acetoacetyl-CoA, das erste Zwischenprodukt der PHA-Synthese, gebildet wird. Im Zytosol der Zellen findet aber auch der Mevalonatweg f{\"u}r die Isoprensynthese statt. Daher liegt sowohl eine Konkurrenz um Acetyl-CoA als auch um Acetoacetyl-CoA vor. Diese Konkurrenzen f{\"u}hren dazu, dass keine PHA-Synthese in den PHA-Transformanten stattfindet. Deswegen wird postuliert, dass stattdessen die Fetts{\"a}uresynthese, der Glyoxylatweg und der Mevalonatweg unterst{\"u}tzt werden. Intensivere Untersuchungen der Stoffwechselwege in A. adeninivorans m{\"u}ssen noch kl{\"a}ren wie Zitronens{\"a}urezyklus und Glyoxylatweg sowie Fetts{\"a}ure- und Isoprensynthese in dieser Hefe gesteuert werden k{\"o}nnen, um ein „metabolic engineering“ zur PHB-Synthese, wie es in S. cerevisiae bereits m{\"o}glich ist, auch in A. adeninivorans zu realisieren. Dazu m{\"u}ssen nach der Expression der rekombinanten Proteine der PHA-Synthese auch die Intermediate der Stoffwechselwege gezielter nutzbar und konkurrierende Enzymaktivit{\"a}ten inhibiert werden.},
  language  = {de}
}