@phdthesis{Pioch2008, author = {Daniel Pioch}, title = {Monitoring von Fermentationsprozessen mithilfe von elektrischen Biochips}, journal = {Monitoring of fermentation processes by means of electrical biochips}, url = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000551-2}, year = {2008}, abstract = {Die at-line Expressionsanalyse von Bioprozess-relevanten Markergenen auf der Grundlage von elektrischen Biochip-Verfahren ist eine viel versprechende Strategie f{\"u}r eine prozessbegleitende Beurteilung der Zellphysiologie des Produktionswirtes. Eine derartige direkte Methode f{\"u}r die Bestimmung des physiologischen Status w{\"u}rde zu einer umfassenderen {\"U}berwachung und Kontrolle von industriellen Fermentationsprozessen beitragen. Die Expressionsanalyse der Markergene mit den verwendeten elektrischen Biochips beruht auf dem Nachweis der entsprechenden mRNA {\"u}ber eine Sandwich-Hybridisierung und der elektrochemischen Detektion der Hybride. Hierbei sind sowohl Bead-basierte als auch Array-basierte Formate m{\"o}glich. Der Bead-basierte mRNA-Nachweis nutzt paramagnetische Partikel (Beads) f{\"u}r die Immobilisierung von Gen-spezifischen F{\"a}ngersonden. W{\"a}hrend der Hybridisierung wird die nachzuweisende mRNA auf den Beads gebunden. Gleichzeitig hybridisiert eine Detektionssonde in einem anderen Bereich der mRNA und erm{\"o}glicht so die Markierung mit einem Enzym. Dieses setzt para-Aminophenol (pAP) frei, das an den Elektroden des Biochips {\"u}ber zyklische Oxidations- und Reduktionsprozesse (Redox-Recycling) amperometrisch detektiert wird. Der resultierende elektrische Strom dient als Ma{\"s} f{\"u}r die mRNA-Menge in der Probe. Die Array-basierte mRNA-Detektion nutzt elektrische Biochips mit 16 individuell auslesbaren Elektrodenpositionen. In diesem Format werden die F{\"a}ngersonden direkt auf der Elektrodenoberfl{\"a}che immobilisiert. Durch die Hybridisierung wird die nachzuweisende mRNA auf den jeweiligen Elektrodenpositionen gebunden. Die Detektion erfolgt positionsspezifisch {\"u}ber das Enzym-kontrollierte Redox-Recycling von pAP. Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag vor allem auf der Verk{\"u}rzung, Optimierung und Automation der Bead-basierten mRNA-Detektion. Durch erste Optimierungen einzelner Protokollschritte der Bead-basierten Sandwich-Hybridisierung konnte eine Verk{\"u}rzung des Protokolls von urspr{\"u}nglich 4 h auf unter 3 h erzielt werden. Der {\"U}bergang zu einer Sandwich-Hybridisierung in L{\"o}sung f{\"u}hrte vor allem zu einer verbesserten Handhabbarkeit und Reproduzierbarkeit des Protokolls. Die Neuanordnung der Sondenbindestellen auf der Ziel-mRNA und die Einf{\"u}hrung einer zweiten Detektionssonde resultierten in signifikanten Steigerungen der Hybridisierungssignale. Dies erm{\"o}glichte eine Verk{\"u}rzung der Detektionszeit auf ca. 75 min. Durch weitere Optimierungen einzelner Aspekte des Protokolls konnte schlie{\"s}lich eine mRNA-Detektionszeit von ca. 45 min realisiert werden. Somit wurde das Protokoll f{\"u}r die Bead-basierte mRNA-Detektion mit dem elektrischen Biochip, ausgehend von isolierter Gesamt-RNA, von urspr{\"u}nglich 4 h auf 45 min verk{\"u}rzt. Gleichzeitig konnte die Sensitivit{\"a}t des Protokolls um das etwa F{\"u}nffache gesteigert werden. Die Automatisierung mithilfe eines Pipettierroboters erlaubte eine parallele Bearbeitung und die automatische, sequentielle Detektion von 8 Proben innerhalb von ca. 1 h. Weiterhin wurde die Array-basierte mRNA-Detektion etabliert und teilweise optimiert. Dies erm{\"o}glichte eine parallele, elektrochemische Detektion von derzeit 4 verschiedenen mRNAs in einer Probe isolierter Gesamt-RNA innerhalb von 20 min. Allerdings sind vor der automatischen Messung noch zus{\"a}tzliche Schritte f{\"u}r die manuelle Bearbeitung der RNA-Proben (ca. 25 min) erforderlich. Die Anwendbarkeit der entwickelten Protokolle wurde jeweils am Beispiel von ausgew{\"a}hlten Markergenen des industriell bedeutsamen Wirtes Bacillus licheniformis getestet. Die mithilfe der elektrischen Biochip gemessenen Expressionsprofile der Markergene korrelierten mit den mittels real-time RT-PCR bestimmten mRNA-Mengen. Somit konnte im Rahmen der vorliegenden Dissertation die Grundlage f{\"u}r eine Bioprozess-begleitende mRNA-Analytik, basierend auf elektrischen Biochips, geschaffen werden.}, language = {de} }