@phdthesis{Mueller2015,
  author    = {Marret M{\"u}ller},
  title     = {Charakterisierung des Alkalischen Schock Proteins Asp23 in Staphylococcus aureus},
  journal    = {Characterization of the alkaline shock protein Asp23 in Staphylococcus aureus},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002144-2},
  year      = {2015},
  abstract  = {Selbst bei intensiv erforschten Modellorganismen ist die Funktion von mindestens einem Drittel der codierten Proteine bis heute vollkommen unbekannt. Dies trifft auch auf das Gram-positive, fakultativ pathogene Bakterium Staphylococcus aureus zu. Mit 25.000 Molek{\"u}len pro Zelle ist das alkalische Schock Protein Asp23 eines der abundantesten Proteine in S. aureus. Abgesehen davon, dass die Expression von asp23 unter alkalischen Schock Bedingungen induziert ist, weshalb es seinen Namen erhielt, und dass es alleinig \σB-abh{\"a}ngig transkribiert wird und somit gut als Marker f{\"u}r \σB-Aktivit{\"a}t geeignet ist, war {\"u}ber Asp23 zu Beginn dieser Arbeit nichts bekannt. Das asp23-Gen liegt in einem tetracistronischen Operon. Bestandteil dieses Operons sind au{\"s}erdem opuD2, das f{\"u}r einen Transporter f{\"u}r Osmoprotektantien codiert, und SAOUHSC\_02442 und SAOUHSC\_02443, die beide f{\"u}r Membranproteine unbekannter Funktion codieren. Interessanterweise enthalten sowohl Asp23 als auch SAOUHSC\_02443 eine DUF322-Dom{\"a}ne. DUF322-Dom{\"a}nen sind in Gram-positiven Bakterien sehr konserviert und kommen normalerweise in mehreren Kopien pro Genom vor. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass das cytoplasmatische Protein Asp23 nahe der Membran lokalisiert ist. Dabei konnte Asp23 entlang der gesamten Membran nachgewiesen werden. Auff{\"a}llig war jedoch, dass in sich teilenden Zellen die Stellen frei von Asp23 blieben, wo sich das neue Septum gebildet hat. Nur in Zellen, die sich vermutlich in einem fortgeschrittenen Stadium der Zellteilung befanden, konnte auch am Septum Asp23 nachgewiesen werden. Da f{\"u}r Asp23 selbst keine Transmembrandom{\"a}nen vorhergesagt werden, wurde untersucht, ob eines der im asp23-Operon codierten Membranproteine an der Verankerung von Asp23 an der Membran beteiligt ist. Dazu wurden Deletionsmutanten der drei Gene opuD2, SAOUHSC\_02443 und SAOUHSC\_02442 konstruiert und die Lokalisation von Asp23 in diesen Mutanten fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Ein eindeutiger Einfluss auf die Lokalisation von Asp23 konnte nur f{\"u}r die Deletion von SAOUHSC\_02443 nachgewiesen werden. Mittels BACTH-Analyse konnte au{\"s}erdem eine direkte Interaktion zwischen SAOUHSC\_02443 und Asp23 gezeigt werden. SAOUHSC\_02443 ist somit ma{\"s}geblich an der Verankerung von Asp23 an der Membran beteiligt und wurde deshalb als „Asp23 membrane anchoring protein“, kurz AmaP, benannt. Mithilfe des BACTH-Systems wurden zudem alle theoretisch m{\"o}glichen Interaktionen zwischen den im asp23-Operon codierten Proteinen untersucht. Dabei konnten Selbstinteraktionen von allen vier Proteinen, OpuD2, AmaP, SAOUHSC\_02442 und Asp23, nachgewiesen werden und eine Interaktion zwischen SAOUHSC\_02442 und der Membrandom{\"a}ne von AmaP. Die Selbstinteraktion von AmaP wird {\"u}ber dessen Membrandom{\"a}ne vermittelt. F{\"u}r die Selbstinteraktion von Asp23 ist hingegen dessen DUF322-Dom{\"a}ne in Kombination mit dem C-Terminus wichtig. Die Interaktion zwischen Asp23 und AmaP konnte nur dann nachgewiesen werden, wenn AmaP intakt war, was daf{\"u}r spricht, dass AmaP eine von seinem Membranteil abh{\"a}ngige Quart{\"a}rstruktur einnehmen muss, um die Bindungsstelle f{\"u}r Asp23 zu bilden. Da neben der mittels BACTH-Analyse gezeigten Selbstinteraktion von Asp23 auch Ergebnisse von Gelfiltrationsexperimenten daf{\"u}r sprachen, dass Asp23 polymere Strukturen ausbildet, wurde Asp23 mit einem Strep-tag in Escherichia coli exprimiert, gereinigt und mittels Elektronenmikroskopie visualisiert. So konnte gezeigt werden, dass Asp23 in vitro spiralig gewundene, bis zu mehrere Mikrometer lange Filamente bildet. Im Zuge einer strukturellen Charakterisierung der Filamente wurden drei Punktmutationen in Asp23 identifiziert (K51A, E106A, K117A), die die Filamentbildung in vitro beeintr{\"a}chtigten. In einer vergleichenden Transkriptionsanalyse der asp23-Deletionsmutante und des Wildtyps konnten 16 in der asp23-Mutante hochregulierte Gene identifiziert werden. Darunter waren viele Gene, die zum Vancomycin-Stimulon geh{\"o}ren. Mittels Northern Blot konnte das Ergebnis der DNA-Microarray-Analysen best{\"a}tigt werden. Zudem konnte so gezeigt werden, dass die in der asp23-Mutante hochregulierten Gene auch in der amaP-Mutante hochreguliert sind, in der Asp23 vorhanden, aber delokalisiert ist. Die ph{\"a}notypische Charakterisierung deutet somit ebenso wie die Lokalisation von Asp23 auf eine Zellwand-assoziierte Funktion hin.},
  language  = {de}
}