@phdthesis{Kessler2019,
  author    = {Catharina Ke{\"s}ler},
  title     = {Proteomanalyse der Partikel des Virus der afrikanischen Schweinepest und ASFV infizierter S{\"a}ugetierzellen},
  journal    = {Proteome analysis of African swine fever virus particles and ASFV infected cell cultures},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-27468},
  pages     = {150},
  year      = {2019},
  abstract  = {Die Afrikanische Schweinepest (ASP) ist eine Viruserkrankung, die Mitglieder der Suidae-Familie wie Buschschweine, Warzenschweine, Hausschweine und Wildschweine bef{\"a}llt. Das Virus wird durch direkten Kontakt zwischen infizierten und naiven Tieren, durch Zecken der Gattung Ornithodoros oder durch Kontakt mit kontaminiertem Material {\"u}bertragen. W{\"a}hrend die Krankheit bei Warzenschweinen und Buschschweinen im Allgemeinen asymptomatisch verl{\"a}uft, verursacht die ASP eine hohe Mortalit{\"a}t bei Hausschweinen und Wildschweinen. Daher ist die j{\"u}ngste Ausbreitung von ASP in Europa eine ernste Bedrohung f{\"u}r die Schweinehaltung in der EU. Bis heute ist keine wirksame Behandlung oder Impfung verf{\"u}gbar. Und es liegen nur wenige Informationen {\"u}ber Virus-Wirt-Wechselwirkungen vor, die als Grundlage f{\"u}r die Etablierung antiviraler Strategien verwendet werden k{\"o}nnten. Das Virus der afrikanischen Schweinepest (African swine fever virus, ASFV) ist der einzige bekannte Vertreter der Familie der Asfarviridae. Das DNA-Genom des ASFV kodiert f{\"u}r {\"u}ber 150 Gene. {\"U}ber die Expressionsprodukte ist wenig bekannt, nur wenige virale Proteine sind bisher funktionell charakterisiert. Die Morphogenese von ASFV ist sehr komplex. So entstehen neben den zweifach umh{\"u}llten reifen extrazellul{\"a}ren Virionen auch einfach umh{\"u}llte intrazellul{\"a}re Partikel, die die die Pr{\"a}paration reiner extrazellul{\"a}ren Virionen erschweren. In fr{\"u}heren in vitro Studien wurde die Zusammensetzung der extrazellul{\"a}ren Viruspartikel mittels 2D-Gelelektrophorese analysiert. Die Reinigung erfolgte {\"u}ber ein im Jahre 1985 ver{\"o}ffentlichtes Reinigungsprotokoll, welches auf einer Percolldichtegradientenzentrifugation und einer Gelchromatographie basierte. Das Protokoll wurde f{\"u}r die Reinigung des auf Vero-zellen adaptierten Virusstamm Ba-71V etabliert. In einer fr{\"u}hen MS Studie wurden 54 Proteine in ASFV Partikeln detektiert, 15 davon Wirtsproteine. Der Einbau von Aktin, α-Tubulin und β-Tubulin ins Virion konnte ebenfalls best{\"a}tigt werden. Systematische massenspektrometrische Untersuchungen zur Charakterisierung des Proteoms der ASF Virionen lagen zu Beginn der vorliegenden Dissertation nicht vor, erst w{\"a}hrend der Anfertigung des Manuskripts wurde eine solche Studie durch Alejo et al. ver{\"o}ffentlicht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein auf einer Dichtegradientenzentrifugation ohne nachfolgende Gelchromatographie beruhendes Reinigungsprotokoll entwickelt und die Zusammensetzung reifer ASF Viruspartikel mittels MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie analysiert. Zur Anzucht einer GFP-positiven ASFV OUR T88/3 Mutante wurde die vom Wildschwein abstammende Zelllinie WSL-HP verwendet. Wesentliche Schritte der Reinigung waren eine niedertourige Zentrifugation zur Entfernung zellul{\"a}rer Verunreinigungen, gefolgt von einer Sedimentation des Virus durch ein Saccharosekissen und einem Proteaseverdau. Final wurde die Pr{\"a}paration {\"u}ber einen selbstgenerierenden Optiprep™ Dichtegradienten gereinigt. Die Titerausbeute lag zwischen 30 und 70 \%, die spezifische Infektiosit{\"a}t bei 2,4 x 109 TCID50/mg. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die Pr{\"a}paration zwar Virionen enthielt, aber auch, dass die Fixierung mit Glutaraldehyd die Stabilit{\"a}t der Virionen beeintr{\"a}chtigt. In der massenspektrometrischen Analyse wurden 29 der 33 bekannten ASFV Strukturproteine best{\"a}tigt. Von den neu identifizierten Strukturproteinen konnten vier (pK145R, pC129R, pE146L und pI73R) in allen drei Replikaten und sechs in zwei von drei Replikaten (p5, CP123L, CP312R, E184L, M1249L und M2248R) best{\"a}tigt werden. Ein weiteres bis dato nicht charakterisiertes Protein, p285L, konnte als m{\"o}gliches neues Strukturprotein identifiziert werden. 152 Wirtsproteine wurden im Virion detektiert, darunter haupts{\"a}chlich Membranproteine oder Proteine des Zytoskeletts. Daneben wurde eine Reihe an phospholipidbindenden Proteine gefunden. Unter den identifizierten Proteinen waren f{\"u}nf aus dem glatten ER und einige Vertreter der Hitzeschockproteine. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte das intrazellul{\"a}re Proteom des ASFV identifiziert werden. F{\"u}r diese Untersuchungen wurden drei empf{\"a}nglichen Zelllinien verwendet, die vom Wildschwein abstammenden Linie WSL-HP, Vero Zellen, die in der Vergangenheit f{\"u}r viele Studien herangezogen wurde und die menschliche Linie HEK-293, die aus einem weiteren nicht empf{\"a}nglichen Wirt stammt. Der in dieser Studie verwendete Virusstamm ASFV OUR T88/3 besitzt 157 ORFs. In fr{\"u}heren Studien konnte die Existenz eines Proteins f{\"u}r 44 ORFs best{\"a}tigt werden. F{\"u}r weitere 69 ORFs wurden Transkripte, nicht aber die korrespondierenden Proteine, beschrieben, sodass f{\"u}r 44 ORFs kein Nachweis der Expression vorlag. In der massenspektrometrischen Analyse wurden je Wirtszelle rund 1000 Proteine identifiziert. Insgesamt belief sich die Zahl der identifizierten ASFV Proteine auf 94, davon 88 in WSL-HP, 83 in Vero und 57 in HEK-293 Zellen. 54 ASFV Proteine wurden in allen drei Zelllinien detektiert. F{\"u}r 34 der identifizierten ASFV Proteine war bisher nur die Existenz des Transkripts beschrieben, f{\"u}r 23 weitere weder die Existenz eines Proteins noch eines Transkripts. F{\"u}r 44 der 94 identifizierten Proteine wurde das N-terminales Peptid detektiert. Bei f{\"u}nf der MGF-110 Proteinen (1L, 2L, 4L, 5L und 14L) und den Proteinen pI329L und pCP123L wurde die Abspaltung der vorhergesagten Signalsequenz experimentell best{\"a}tigt. Die MS Analysen wurden unter Verwendung des emPAI auch quantitativ ausgewertet. Die geringe Zahl detektierter ASFV Proteine in HEK-293 Zellen korrelierte mit dem geringeren Anteil an ASFV Proteinen im Gesamtproteingehalt der Zelle (6,3 Mol\%). Allerdings wurden einige Proteine in HEK-293 Zellen {\"a}hnlich stark oder sogar st{\"a}rker exprimiert als in Vero bzw. WSL-HP Zellen. Die Abundanz einzelner ASFV Proteine variierte in den verschiedenen Zelllinien. Einige wurden jedoch durchgehend stark exprimiert wie z.B. das Strukturprotein p11.5. Einige bisher nicht charakterisierte Proteine, wie z.B. pK145R, pI73R und pC129R, wurden {\"u}berraschenderweise ebenfalls in allen Zellen stark exprimiert und sind somit m{\"o}glicherweise Tr{\"a}ger wichtiger viraler Funktionen, die weiter untersucht werden sollten.},
  language  = {de}
}